基于毛细管电泳的天然产物中酶抑制剂筛选研究进展

李 凤, 张艳梅, 康经武

(1. 西安文理学院化学工程学院, 陕西 西安 710065; 2. 上海市农业科学院, 农产品质量标准与检测技术研究所, 上海 201403; 3. 生命有机化学国家重点实验室, 中国科学院上海有机化学研究所, 上海 200032)

生物体内各种酶参与调节细胞的生长、分化、凋亡等几乎所有的生理过程,对细胞信号通路的调控起着非常关键的作用。威胁人类健康的几类重大疾病如癌症、糖尿病及高血压等被发现与相关酶的失调密切相关,因此酶是目前新药研发的重要靶标。同时酶抑制剂已成为全球排名第二的热门靶向药物,是各大制药公司研发的热点。迄今为止,已有37个用于治疗癌症的小分子蛋白激酶抑制剂(protein kinase inhibitors, PKIs)获得美国食品药品管理局(FDA)批准上市,另外还有大约150多个抑制剂正处在临床实验阶段[1]。天然产物具有丰富的化学结构多样性和良好的成药性,是发现药物的重要资源。从合成化合物库中进行高通量筛选(HTS)的命中率小于0.001%,从天然产物中筛选到新药的命中率却能高达0.3%[2]。Newman和Cragg[3]对1981年到2014年间全球上市的新药的来源做了统计,发现这34年间上市的1 211种小分子药物中,有65%上市药物都是来源于天然产物及其衍生物。从天然产物中寻找活性化合物(比如酶抑制剂),解析其化学结构,之后进行构效关系研究(structure activity relationships, SAR)得到先导化合物,是当前我国新药研究的重要领域之一,同时也是实现中药“走出去”的必经之路。天然产物分离纯化过程耗时费力,一直是药物筛选的决速步骤。而基于光谱或者放射性检测的高通量筛选模式,难适用于成分复杂的天然产物。因此,发展快速、可靠和有效的酶抑制剂筛选技术,用于复杂天然产物中活性成分筛选,特别对明确中药的药理作用具有非常重要的现实意义。

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),具有分离效率高、分析速度快、操作简单、样品和试剂用量少、分离模式多以及抗基质干扰能力强等优点[4]。由于不使用固定相,样品基质不容易污染毛细管柱,因此可以直接筛选天然产物粗提物,实现底物和产物的分离和检测。Banke等[5]将CE用来研究碱性蛋白酶的活性,从此开启了CE在酶学研究中的应用,包括酶活性测试、酶动力学的研究、酶底物的鉴定以及酶抑制剂的筛选等[6-8]。近年来,CE在药物分析和药物筛选研究中的应用越来越受到重视[9,10]。基于此,本文对CE在天然产物中酶抑制剂筛选的研究进展进行了综述,总结了近10年来CE在天然产物中酶抑制剂筛选中的应用实例(见表1),希望有助于该技术的普及和推广。

1 毛细管电泳用于抑制剂筛选的基本技术简介

采用CE进行酶活测试和酶抑制剂筛选,主要有两种方式[6,10]:一是离线模式(off-line或pre-capillary assay),二是在线模式(on-line或in-capillary assay)。

1.1 离线分析

离线模式下,CE仅作为一种分离工具。酶、底物、辅助因子或者其他必需的化合物在柱外混合均匀并孵育后,再将酶反应液导入毛细管柱进行分离和检测,通过测定产物或底物的峰面积变化计算酶反应动力学、抑制动力学以及抑制活性。离线的酶活测定方法简单,可以各自优化反应条件和分离条件。但也存在着一些不足之处:首先,柱外的酶反应与柱上的样品分析之间存在一定的时间差,因此在进样分析之前必须将酶反应淬灭;其次,柱外的酶反应消耗至少微升级的试剂量。为了实现真正意义上纳升规模的筛选,非常有必要将酶反应由柱外转移到只有纳升级测定体积的毛细管柱内。因此,近年来,在线的酶活测定新技术发展十分迅速。

1.2 在线分析

在线的CE活性测试和抑制剂筛选,可以实现柱上反应、分离和检测的一体化。毛细管不仅可以用作分离通道,同时也可以用作酶反应容器。已经发展出的方法有均相测试方法-电泳介导的微分析(electrophoretically mediated microanalysis, EMMA)和非均相测试方法-固定化酶微反应器(immobilized enzyme microreactor, IMER)[71]。

1.2.1电泳介导的微分析

EMMA是Bao和Regnier[72]在1992年首次提出,用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的在线活性测试。基本原理是将毛细管柱头作为微反应器,通过电泳或者扩散作用使得酶和各个反应因子混合均匀,最终根据各个物质电泳淌度的不同将底物和产物进行分离。EMMA用于酶活测试和抑制剂筛选具有非常突出的优势:(1)参与酶反应的各个物质的混合可以采用电泳混合或者扩散混合两种模式;(2)混合、反应、分离以及检测都在一根毛细管柱内进行,提高了分析的效率,非常适合于短寿命反应产物的检测以及快速反应动力学的研究;(3)试剂和样品消耗量小,大大降低了筛选成本;(4)便于自动化和高通量。

近年来,除了传统的连续模式(zonal EMMA)被广泛应用外,一系列新的EMMA模式也被广泛报道,包括区带-区带模式(plug-plug EMMA)、部分填充模式(partial-filling EMMA)、快速极性反转模式(rapid polarity switching EMMA)、纵向扩散模式(at-inlet longitudinal diffusion)、层流剖面的横向扩散模式(transverse diffusion of laminar flow profile, TDLFP)等。

1.2.2固定化酶微反应器

毛细管固定化酶微反应器结合了固定化酶和CE两者的优势,通过固定化使靶标酶的稳定性得到提高且可重复利用,同时CE纳升规模的溶液操作性能进一步减少试剂的消耗量,从而大大降低分析成本[73,74]。CE的高分离选择性可消除复杂样品基质及化合物样品之间的相互作用对检测带来的干扰,不仅有效地提高了分析的准确性,同时也为混合物的筛选提供了又一多样化的分析平台。与EMMA技术的均相酶活性测定相比,毛细管固定化酶微反应器因无需反应物之间的混合步骤而使得酶活测定更为简便和直接,且同时适用于带电化合物和中性化合物的分析。

2 CE在药物筛选中的应用

2.1 转移酶(transferases)

蛋白激酶(protein kinase)是一类重要的磷酸转移酶,催化蛋白质的磷酸化过程。它参与调控细胞生长、分化以及凋亡等生理过程,对细胞信号通路的调控也起着非常关键的作用。蛋白激酶的失调往往与各种疾病,如炎症、高血压、糖尿病、关节炎,特别是癌症紧密相关,已经成为继G蛋白偶联受体之后第二大类最重要的药物靶标。蛋白激酶根据磷酸受体不同分为五大类,包括丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶、组氨酸激酶、半胱氨酸激酶以及天冬氨酸/谷氨酸激酶。由于激酶反应涉及磷酸根的转移,导致底物与产物有较大的电泳淌度差异,所以CE特别适合蛋白激酶抑制剂的筛选。早期,Gratz等[11]以酪蛋白激酶2(CK2)为模型,建立离线CE-UV检测磷酸化前后底物的变化,实现了CK2的酶活性测试和抑制剂筛选。康经武课题组[12]基于EMMA技术,建立了直接检测三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)生成量的通用型激酶抑制剂筛选技术。同时以己糖激酶为模型,考察了抑制剂3-溴丙酮酸(3-BrPA)的抑制动力学,证明该方法具有简单、快速以及经济的特点。近年来,Okhonim等[75]提出一种在线混合反应物的新方法,即TDLFP。它是将每种反应物溶液以较大压力短时间进样,使得样品在毛细管柱内呈层流抛物线,每个反应物溶液都会穿过上一个反应物,最后再以相同方式注入酶反应的缓冲溶液,使之前进样的反应物通过轴向界面的横向扩散实现均匀混合,有利于产物的快速生成。Nehmé等[13]将CE-TDLFP技术用于天然黄酮化合物库中靶向细胞周期依赖激酶5/p25(CDK5/p25)和葡萄糖合成激酶3β(GSK3β)抑制剂的筛选,最终实现了复杂体系沙棘粗提物的活性测试。该课题组[14]还将该筛选技术应用于天然黄酮类化合物中靶标蛋白激酶CDK5/p25、细胞周期依赖激酶1/周期蛋白B (CDK1/cyclin B)抑制活性评价中。进一步利用CE分离结合UV检测二磷酸腺苷(adenosine diphophate, ADP)的产生,从而实现了蛋白激酶信号通路PI3K/AKT/mTOR的活性测试以及抑制剂筛选[16]。Zhang等[76]发展了一种基于激光诱导荧光毛细管电泳(capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detector, CE-LIF)检测的多个细胞内源激酶的抑制剂平行筛选及选择性评价方法。CE高效的分离能力和LIF检测器的高选择性使得同时测试多个胞内激酶的活性成为可能。

图1 毛细管电泳结合高效液相色谱-质谱联用的酶抑制剂的筛选流程图[17-20]Fig. 1 Schematic illustration of the workflow for screening enzyme inhibitors by CE in combination with HPLC-MS[17-20]

近年来,康经武课题组[17]还建立了CE-LIF结合高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用的天然产物粗提物中酶抑制剂的筛选方法。该方法的流程图见图1,利用CE可以直接测定天然产物粗提物的活性。用CE跟踪HPLC分离纯化的各个成分,利用HPLC-MS/MS对其活性成分进行结构鉴定。将该方法用于筛选天然产物中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制剂。首次从丹参粗提物中筛选了两个抑制作用为亚微摩尔级的新mTOR抑制剂丹酚酸A和丹酚酸C。之后,采用相同的策略建立了受体酪氨酸激酶表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂筛选和选择性评价方法[18],最终将其应用于39种中药粗提物组成的化合物库中进行筛选,对筛选的活性粗提物进行进一步的活性成分追踪。最终,鉴定得到泽兰中槲皮素和芦丁是EGFR的抑制剂,其半数抑制浓度(IC50)分别为0.88 μmol/L和10.1 μmol/L。基于CE-EMMA技术,我们[19]还建立了蛋白激酶A(PKA)抑制剂筛选方法,将其用于33种天然产物粗提物中抑制剂的筛选,通过活性追踪筛选,最终从黄芩粗提物中筛选到黄芩苷具有较强的抑制PKA活性的作用,其IC50值为0.69 μmol/L。最近,我们[20]还基于CE-LIF进一步建立了断裂点簇集区-艾贝尔森激酶(BCR-ABL)抑制剂的筛选方法,从37种中药小分子化合物库中筛选到木犀草素和表儿茶素没食子酸酯具有较强的抑制活性,其IC50值分别是5.4 μmol/L和4.8 μmol/L。实验中,我们用药物筛选中的统计学Z′因子评价上述筛选数据的质量。结果计算得到的Z′因子均大于0.9,远大于可信度的阈值0.5,证实了CE方法用于抑制剂筛选的可靠性。

上述一系列的研究工作表明,将HPLC-MS的结构鉴定和CE的高效筛选相结合,直接用于中药粗提物的活性成分筛选可以实现高效率的药物筛选。由于采用了CE作为分离工具,有效地避免了样品基质对筛选的干扰,对于复杂样品体系(如中药粗提物等)可以直接进行活性筛选跟踪,无需繁琐的样品前处理步骤,为系统性研究开发天然产物,阐明活性成分的作用机理提供了强有力的分析工具。

2.2 水解酶(hydrolase)

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)能催化α-1,4-糖苷键水解,抑制α-葡萄糖苷酶的活性从而抑制餐后高血糖,可以有效预防糖尿病并减少并发症的产生。Guo等[24]将CE-EMMA应用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选,实现了21种中药提取物中酶抑制剂的筛选。Zhang等[26]制备了α-葡萄糖苷酶固定化酶微反应器来筛选其抑制剂。首先利用纳米金颗粒与巯基之间的作用,将纳米金颗粒共价结合到毛细管整体柱的多孔聚合物表面,然后将酶固定在纳米金颗粒上,从11种天然产物粗提物中成功筛选出α-葡萄糖苷酶抑制剂。Liu等[27]将α-葡萄糖苷酶固定在磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子上,Fe3O4粒子预先经壳聚糖修饰,随后将所得纳米粒子与戊二醛反应,在磁性纳米粒子外层修饰醛基,最后利用酶氨基与醛基作用将酶固定。磁性固定化酶与底物进行反应后,只需施加一个外加磁场就可以将其和反应混合物实现快速分离。

神经氨酸酶(neuraminidase, NA)具有唾液酸酶活性,在甲型、乙型流感病毒的复制、感染和致病过程中起重要作用。因此,筛选NA抑制剂是研究和开发抗病毒药物的重要途径。Zhao等[28]通过戊二醛交联制备了NA固定化酶微反应器,实现了在线筛选其抑制剂。考察了18种天然产物的抑制活性,并对有活性的8种组分按活性大小进行了排序。Jiang等[29]也建立了基于CE的NA活性测试的方法,实验中优化了反应和分离分析条件,将建立的方法用于复杂体系可口革囊星虫粗提物中抗流感病毒抑制剂的筛选,最终筛选出7种对NA有抑制活性的粗提物。

酪氨酸酶(tyrosinase, TRS)是黑色素生物合成的关键酶,化妆品市场上的美白产品以TRS抑制剂为主。TRS活性过高会引起黑色素沉积,从而引发皮肤色素性疾病。Tang等[30]将CE-EMMA应用于传统中药中TRS抑制剂的筛选。该课题组[31]还发展了化学键合的TRS微反应器。Jiang等[32]通过层层自组装方式在毛细管柱端构建“聚电解质-酶-聚电解质”的三明治夹心结构,制备得到离子键合的固定化TRS微反应器,连续酶分析25次后,酶活性只损失了12%,最终从19种中药粗提物中筛选出了2种活性粗提物。Su等[33]基于Zn(Ⅱ)-L-leucine和β-环糊精(β-CD)的螯合作用构建了手性配体交换毛细管电泳(CLE-CE)体系用于TRS抑制剂的筛选。

腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)是一种氨基水解酶,将腺嘌呤核苷水解催化成为次黄嘌呤核苷。由于ADA和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)是嘌呤代谢的关键酶, Lin等[34]同时将ADA和XOD固定在金纳米粒子上制备了双酶固定化微反应器,将两种酶的底物混合进样,结果表明,使用双酶固定化酶微反应器不仅方便、快速、成本低,而且可以同时评价两种酶的抑制剂活性。最近,Qi等[35]又报道了ADA和嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase, PNP)双酶抑制剂筛选方法。作者将红细胞裂解液作为天然酶源进行天然产物中抑制剂的筛选,巧妙地应用了ADA的产物次黄嘌呤核苷作为PNP的底物,并对方法进行了验证,同时还首次报道了当归对ADA的抑制作用。Ji等[36]采用聚阴离子电解质海藻酸钠包埋ADA,然后通过静电作用将其固定在修饰了聚阳离子涂层的毛细管进样端,实现了在线筛选ADA抑制剂。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)属于蛋白水解酶家族,可降解很多细胞外基质成分。MMPs活性的紊乱,会导致肿瘤细胞的入侵、迁移以及血管增生,因此MMPs已成为重要的癌症靶标和生物标志物。Hai等[37]首次建立了EMMA在线荧光检测MMPs抑制剂的筛选方法。以MMP-2和MMP-9为模型酶,合成的荧光标记多肽作为底物,采用短端进样的方法依次将酶、底物和抑制剂注入毛细管,在正负电压作用下,三者进行混合并在线反应、分离和检测,实现了多种MMPs候选抑制剂(没食子酸酯、油酸、白藜芦醇、槲皮素、咖啡酸、葡糖胺和多西环素)的活性评价。之后,该课题组[38]进一步将CE-ESI-MS联用技术应用于MMP-9抑制剂的筛选中,大大提高了方法的灵敏度,抑制剂的检出限低至nmol/L级。

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, ACHE)抑制剂可以通过抑制ACHE的活性从而维持神经系统中乙酰胆碱的正常水平。目前ACHE抑制剂是临床上用于改善阿尔茨海默病(alzheimer′s disease, AD)患者认知障碍的常用药物,因此筛选ACHE抑制剂具有重要的现实意义。Min等[40]在前人的基础上,通过层层自组装方式在毛细管柱端构建“聚电解质-酶-聚电解质”的三明治夹心结构,制备得到离子键合的固定化酶微反应器。利用具有生物兼容性的稳定剂壳聚糖和藻酸盐,大大提高了ACHE固定化酶反应器的稳定性,并成功应用于天然产物中ACHE抑制剂的筛选。康经武课题组[41]基于CE-EMMA技术,建立了ACHE的酶活测试和酶抑制剂筛选方法。我们[42]采用半制备HPLC对黄连粗提物进行分离制备,再基于EMMA的ACHE抑制剂筛选方法进行黄连粗提物的活性成分跟踪筛选。最终,筛选出黄连粗提物中有7种生物碱(表小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀、小檗碱)对ACHE有不同程度的抑制作用。

其他的水解酶还包括胰蛋白酶、胃蛋白酶等。Yin等[43]利用氧化石墨烯与胰蛋白酶之间的静电吸引,使用静电层层组装,实现了双层酶的固定,大大增加了酶的固载量。他们利用CE-IMER实现了在线分析牛血清白蛋白(BSA)的酶解肽段,与溶液中胰蛋白酶酶解12 h得到的肽段数量相当。Min等[44]利用双功能试剂戊二醛制备了胰蛋白酶微反应器,并且成功地从19种天然产物提取物中筛选出胰蛋白酶抑制剂。Zhang等[45]利用戊二醛与酶末端的氨基反应,将胃蛋白酶固定在毛细管整体柱上,实验表明在连续反应40次后,胃蛋白酶的活性仍能保持95.9%;将制备的酶微反应器放置在4 ℃冰箱里面36天,酶活性仅损失15.1%;最终,作者将制作的胃蛋白酶微反应器用于9种天然产物中抑制剂的筛选。

2.3 氧化还原酶(oxidoreductases)

单胺氧化酶B(monoamine oxidase B, MAO-B)和XOD是常见的氧化还原酶抑制剂筛选的靶标酶分子,可催化分子氧作为电子受体参与一系列氧化还原反应。特别是,MAO-B在调节内源性单胺类神经递质如多巴胺代谢中起关键作用。Hu等[52]使用毛细管进样端作为酶反应器,从天然产物中成功筛选出MAO-B抑制剂;在最优条件下,2 min内就实现了底物、产物和酶的分离;最终从16种粗提物库中筛选出山楂和何首乌对MAO-B有抑制活性。Li等[53]使用蛋白-脂质体复合物进行柱外MAO-B抑制剂的筛选,通过加入含乙二胺四乙酸(EDTA)和Na2S2O5的HClO4溶液猝灭反应,与传统的抑制剂筛选方法相比,该法更简单、快速、节省酶源,干扰因素少。XOD是嘌呤分解代谢过程中的一种很重要的酶,催化由黄嘌呤形成尿酸以及次黄嘌呤形成黄嘌呤的氧化过程。XOD抑制剂可以降低血浆中的尿酸含量,临床上可用于痛风患者的治疗。Zhang等[54]以EMMA为手段,采用部分填充的酶反应器技术,建立了一种快速、高效、简便的XOD活力及抑制动力学测定方法;以已知抑制剂4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶(APP)为例,对XOD进行了抑制动力学研究,IC50和Ki分别为30 μmol/L和8 μmol/L;并最终将建立的方法应用于15种天然产物的活性测试。

细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族,它参与大量内源性物质以及包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢过程。Reminek等[55]应用CE-TDLFP建立了细胞色素P450 2C9异构体(CYP2C9)药物代谢的评价方法。以双氯芬酸为底物探针,磺胺苯吡唑为抑制剂探针,对CYP2C9进行了动力学和抑制动力学的研究。在TDLFP模式中,蛋白用量大大减低,单次用量小于30 nL。Asensi-Bernardi等[56]建立了CYP3A代谢药物分子维拉帕米(verapamil, VER)的分析方法。EMMA与部分填充技术结合,加入高度硫酸化的β-环糊精,实现了维拉帕米和去甲维拉帕米的手性拆分。动力学常数测试实验表明,当底物为S-VER时,其Km和Vmax分别是51±9 μmol/L和22±2 pmol/(L·min·pmol CYP),当底物为R-VER时,其Km和Vmax分别是47±9 μmol/L和21±2 pmol/(L·min·pmol CYP)。

2.4 其他酶

Nehmé课题组[62,63]利用短端进样的模式,采用UV和LIF检测方式,建立了离线分析方式和在线分析方式(CE-TDLFP)对人中性白细胞弹性硬蛋白酶(HNE)的4种可能底物多肽进行动力学研究。进一步利用CE-TDLFP-LIF对HNE的抑制反应动力学进行了研究,抑制剂熊果酸的IC50和Ki分别是5.62±0.10 μmol/L、2.81±0.05 μmol/L,抑制剂齐墩果酸的IC50和Ki分别是8.21±0.23 μmol/L、4.11±0.12 μmol/L[62]。另外,他们课题组[63]首次利用微尺寸热泳(microscale thermophoresis, MST)对HNE和熊果酸的相互作用进行了研究,测得HNE-熊果酸复合物的Ki为2.72 μmol/L,这与CE-TDLFP-LIF测得的Ki为2.81±0.05 μmol/L非常吻合。康经武课题组[64]将离线的CE酶活测试方法与HPLC-MS联用技术相结合,实现了组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的酶学研究和酶抑制剂筛选。从38种中药小分子化合物库中,筛选出一种微摩尔级的HDAC抑制剂(木犀草素),其IC50为40 μmol/L。最近,我们[65]还报道了组蛋白去甲基化酶(JMJD3)抑制剂的筛选工作,发现了两种新的JMJD3抑制剂丹酚酸A和葛根素木糖苷。

3 总结和展望

现代药物研发费用极高带来了一系列的问题。提高新药研发的效率首先需要从药物筛选技术上进行改进。相比其他的药物筛选技术,CE在复杂成分样品的分析上具有明显的优势,而且由于低消耗使得运行成本相对较低,完全可以成为一种标准药物筛选的平台。但是受CE普及程度的影响,真正使CE成为一种广泛接受的药物筛选技术还需要很长的路要走。关键在于发展更为简便而且稳定性更好的CE仪器,在使用流程上实现标准化操作,避免过度依赖经验,此外还应该发展新的方法使CE成为不可或缺的药物筛选技术。这些问题的解决将会促进CE在药物研发以及生命分析等领域的普及和广泛应用。