长链非编码RNASNHG5在卵巢癌组织中表达及对卵巢癌细胞自噬影响

沈晓萍 张金春

上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院(202150)

卵巢癌是女性生殖器常见恶性肿瘤之一[1-2]。目前缺乏特异性筛查手段[3]。研究认为卵巢癌是一个多基因、多位点、累积病变过程，涉及细胞增殖、凋亡、自噬、侵袭、转移等多种途径[4-6]。自噬是生命科学研究热点之一，自噬参与卵巢癌肿瘤进展，可能是卵巢癌潜在的治疗途径[7]。长链非编码RNA(lncRNA)在多种恶性肿瘤中发挥重要调控作用，核仁小RNA宿主基因5(SNHG5)在胃癌、结直肠癌中异常表达[8-9]。是潜在的恶性肿瘤治疗靶点，但在卵巢癌中还未见研究。本研究以SNHG5与细胞自噬调控关系为切入点，探讨SNHG5在卵巢癌的作用，为卵巢癌治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 试验材料

取自2017年8月—2019年3月本院因卵巢囊肿/卵巢癌住院行手术者，正常卵巢组织82例(囊肿组)、卵巢癌组织73例(卵巢癌组)。73例卵巢癌组织均为上皮性肿瘤，其中浆液性58例，粘液性15例。患者均知情同意，囊肿组和卵巢癌组组织提供者年龄(35.2±4.1)岁、(35.5±4.4)岁无差异。卵巢癌细胞SKOV3购自中国科学院细胞库。pcDNA3.1(+)质粒、pcDNA3.1-SNHG5重组质粒由本实验室制备。DMEM培养基、10%胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司；实时荧光定量PCR试剂盒(DRR041A)、反转录试剂盒(DRR047A)购自大连宝生物工程有限公司；CCK8相关试剂购于美国Sigma公司；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒购自北京全式金生物公司；鼠抗人LC3-I、LC3-II、beclin 1、GAPDH一抗购及二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG)购自美国Santa Cruz公司；单丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)染色试剂盒购自金克隆(北京)生物技术有限公司。其余试剂购自国药集团，均为分析纯。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 实验方法

1.2.1lncRNA-SNHG5表达参照Trizol说明书提取两组组织总RNA，应用反转录试剂盒逆转录为cDNA，逆转体系为10ul(2 μl 5x Reaction mix/1 μl Random primer/0.5 μl逆转录酶/5 μl RNA样品)，25℃ 5min，42℃30 min，85℃ 5min灭活逆转录酶活性，去离子水将cDNA稀释10倍后-20℃保存。实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测。程序设定：95 ℃预热3 min，95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，上述3步骤35次循环，72℃ 5min终止反应。其中SNHG5 以GAPDH为内参基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物设计见表1。采用2-ΔΔCt算法计算SNHG5相对表达量。

1.2.2细胞培养从液氮罐中取出冻存的SKOV3细胞，快速解冻后离心弃冻存液，用含10%完全培养基悬浮细胞，37℃、5% CO2恒温培养，待细胞贴壁融合至80%时弃培养基，PBS清洗后加入1ml胰酶消化，待细胞分散后去除胰酶，加入含10%胎牛血清的完全培养基2ml，混匀，按1:2的比例开始传代，细胞传至3代时取对数生长期细胞开始计数。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3细胞转染试验分为3组：空白组，含10%FBS的DMEM培养基;阴性对照组，转染空质粒pcDNA3.1(+);SNHG5过表达组，转染重组质粒pcDNA3.1-SNHG5。转染前1天，将SKOV3以2×105/孔接种于6孔板，加2 ml培养基。按照lipofectamineTM2000说明书转染：pcDNA3.1(+)质粒、pcDNA3.1-SNHG5重组质粒稀释液分别与转染试剂lipofectamine 2000稀释液按照1:1比例转染，并验证转染效率，转染后通过400mg/L的G418筛选稳定细胞株，稳定细胞株以400mg/L的G418维持培养。转染后48h收集细胞供后续使用，按照1.2.1中方法检测转染后各组细胞SNHG5表达情况。

1.2.4CCK-8法检测各组SKOV3增殖情况收集上述各组细胞，分别培养24、48、72、96h，每组设6个复孔，加入10 μl CCK-8溶液，培养4h后用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值，并计算细胞增殖抑制率。以未接种细胞质加培养基孔的A值为空白对照调零，细胞增殖抑制率=[1-A处理组/未处理组]×100%。

1.2.5细胞超微结构收集各组细胞制成单细胞悬液，室温离心20min，弃上清，4%戊二醛固定过夜，送本院电镜室摄片透视电镜技术观察。

1.2.6观察细胞自噬囊泡形成情况收集各组细胞，按照单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色试剂盒操作说明染色，荧光显微镜下观察、计数并拍照。每个样本随机选取6个视野，统计视野中MDC染色阳性细胞个数，以核周或胞浆内出现3个以上高密度着色点的细胞即为MDC阳性细胞，试验重复3次。

1.2.7蛋白表达收集各组细胞，加入RIPA裂解液，冰上静置，充分裂解后通过免疫印记法(WB)检测，蛋白提取试剂盒提取总蛋白。使用BCA蛋白试剂盒测定细胞中总蛋白浓度。用10%SDS-PAGE分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜，TBST清洗3次后，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加入一抗LC3-I(1：500)、LC3-II(1：500)、beclin 1(1：1000)，以GAPDH做为内参，24 h后吸取一抗，清洗PVDF膜后，加入相应二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔)37℃封闭1 h，滴加ECL显色液，用凝胶成像系统获取蛋白条带图片，用Tanon 600图像分析系统拍照对蛋白质表达量进行定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 SNHG5在组织中的表达及临床病理

SNHG5相对表达量卵巢癌组(0.49±0.06)低于囊肿组(1.13±0.23)(t=12.982，P=0.000)。以卵巢癌组SNHG5相对表达量将卵巢癌组分为SNHG5高表达组(31例)和低表达组(42例)，卵巢癌组织中SNHG5表达与患者年龄及是否绝经未见差异(P>0.05)，但在组织学分级G3、FIGO分期III～IV期中SNHG5低表达占比高于高表达(P<0.05)。见表2。

2.2 转染效率验证及稳定转染细胞株内SNHG5表达

瞬时转染效率如图1(1935页)所示，转染效率达90%以上。稳定转染后，SNHG5相对表达量， SNHG5过表达组(1.97±0.37)高于空白组(1.03±0.20)和阴性对照组(1.05±0.21)(P<0.05)，但空白组与阴性对照组无差异(P>0.05)。

表2 卵巢癌组不同SNHG5表达与患者临床病理关系[例(%)]

2.3 lnc RNA-SNHG5过表达对SKOV3细胞增殖的影响

转染24h时， SKOV3细胞增殖抑制率3组无差异(P>0.05)。转染48h、72h、96h时，SNHG5过表达组SKOV3细胞增殖抑制率均高于空白组和阴性对照组(P<0.05)。见表3。

2.4 lnc RNA-SNHG5过表达对SKOV3细胞自噬的影响

透射电镜显示，SNHG5过表达组可观测到较多自噬小体结构的存在，可见细胞质和线粒体、内质网等细胞器包裹于双层膜结构(图2)(1935页)。与空白组、阴性对照组相比， SNHG5过表达组MDC阳性细胞占比(42.38±7.64)大于空白组(13.17±1.13)和阴性对照组(15.49±3.57)(P<0.05)。见图3(1935页)。

2.5 lnc RNA-SNHG5过表达对SKOV3细胞自噬相关蛋白的影响

与空白组相比，阴性对照组LC3-I、LC3-II、beclin 1蛋白表达差异不显著，SNHG5过表达组LC3-I蛋白表达量降低，LC3-II、beclin 1蛋白表达升高(均P<0.05)。见图4(1935页)、表4。

表3 各组不同时间SKOV3细胞增殖抑制率比较

表4 各组自噬相关蛋白表达量比较

3 讨论

SNHG5位于6号染色体短臂14区3带，由染色质基因阻断点U50宿主基因的6个外显子组成的剪切体。研究发现，位于基因阻断点位置的基因是肿瘤候选基因的重要指标，与多种癌症的肿瘤恶性生物学行为紧密联系，可通过多种方式影响肿瘤的发生发展[10]。SNHG5在不同恶性肿瘤中既可发挥癌基因作用，又可发挥抑癌基因作用[11]，SNHG5在胃癌、鼻咽癌[12-13]中低表达，发挥抑癌基因作用；而在结直肠癌[14]中发挥促癌基因作用，提示SNHG5表达可能存在组织差异性。本研究中，卵巢癌组织中SNHG5表达显著低于卵巢囊肿组织，提示这种异常表达可能与卵巢癌的发生有关。并且卵巢癌患者的组织学分级、FIGO分期也存在差异，提示SNHG5可能参与了卵巢癌病情进展。

进一步培养卵巢癌SKOV3细胞，并构建过表达SNHG5 SKOV3细胞。结果显示SNHG5过表达后SKOV3细胞增殖能力降低，提示SNHG5过表达可能抑制了SKOV3细胞增殖。自噬与肿瘤关系十分密切。肿瘤形成后，由于过快的增长速度，血液供应不协调，常导致部分肿瘤细胞处于缺氧或饥饿状态，为耐受生存压力，自噬活性增强，促进肿瘤生长存活[15]。近年一些靶向自噬通路的药物研究表明，促进肿瘤细胞自噬性死亡或抑制自噬性保护是消灭肿瘤细胞的有效措施。Wang等[16]研究显示，卵巢癌组织自噬相关蛋白beclin 1表达下调。达沙替尼是治疗慢性髓细胞性白血病的二线药物，可诱导卵巢癌细胞SKOV3发生自噬[17]。此外，白藜芦醇等药物也通过促进细胞自噬抑制卵巢癌细胞增殖[18]。以上研究显示，细胞自噬在卵巢癌中有发挥抑制细胞增殖的作用。本研究发现，SNHG5过表达组SKOV3细胞中可观测到自噬小体，且检测到的高亮点状荧光自噬泡数量高于空白组与阴性对照组，提示SNHG5过表达可促进自噬的形成。LC3是自噬过程中标志蛋白，外源物质刺激细胞自噬启动时，胞浆型的LC3-I分解转化为LC3-II，参与自噬体膜形成[19]。Beclin 1是形成自噬体的必要分子，可介导自噬相关蛋白定位于吞噬泡，并调控自噬体的形成[20]。本研究发现，SNHG5过表达组SKOV3细胞中LC3-II及Beclin 1水平明显上调，表明胞浆中有自噬体膜及吞噬泡形成，提示SNHG5过表达可促进细胞自噬，推测SNHG5可能通过促进细胞自噬来抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖过程。

综上所述，卵巢癌组织中SNHG5低表达，且在不同卵巢癌组织学分级、FIGO分期患者中存在差异；过表达SNHG5可能通过促进细胞自噬抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖。本研究也存在一定不足，仅选择了典型卵巢癌细胞株SKOV3，缺乏动物模型实验等更多证据，此外尽管自噬与凋亡在形态学上存在差别，但许多经典凋亡信号通路与自噬调控存在交叉，下一步将研究SNHG5引起的凋亡与自噬间的互作关系。