抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌的协同抑菌机理

宁亚维，苏 丹，付浴男，韩盼盼，王志新，贾英民,

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）广泛分布于环境中，极易造成食品污染，是食品中常见的食源性致病菌[1]。金黄色葡萄球菌能引起严重的感染，甚至威胁人类和动物的生命，如皮肤和软组织感染、中毒性休克综合征和败血症[2]。因此，抑制食品中金黄色葡萄球菌的生长繁殖对提高食品的安全性至关重要。

抗菌肽brevilaterin是由侧孢短芽孢杆菌产生的具有广谱抑菌活性的小分子肽，具有热稳定性好、生产成本低等优点，作为食品防腐剂具有较好的开发潜力[3]。课题组前期研究发现抗菌肽brevilaterin对细菌、真菌均具有抑菌能力，在与天然防腐剂联合抑菌效应的研究中发现，抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）分别为10 AU/mL、0.015 6 mg/mL，分级抑菌浓度指数为0.5，两者联用具有协同抑菌效应[4]。因此，本研究拟考察抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对金黄色葡萄球菌的抑菌机理，为降低其在食品防腐中的添加量从而降低使用成本提供理论参考。ε-聚赖氨酸是由白色链霉菌产生的阳离子多肽，具抑菌谱广等优点[5-6]。ε-聚赖氨酸作用于菌体细胞后，可通过改变细胞膜通透性[7]、破坏细胞结构[8]、抑制蛋白质合成[9]，以及与菌体DNA结合[10]，从而发挥抑菌作用。Ye Ruosong等[11]对ε-聚赖氨酸的抑菌机理研究表明，ε-聚赖氨酸可以通过活性氧氧化应激以及基因调控等方面发挥抑菌作用。而抗菌肽brevilaterin及其与ε-聚赖氨酸联用的抑菌机理尚不明确，因此本研究将对抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸的联合抑菌机理进行研究。

据报道大多数抗菌肽首先通过破坏细菌细胞膜进入胞内发挥抑菌作用，如抗菌肽LL-37[12]、抗菌肽polyphemusin[13]，但是有些抗菌肽可以不破坏细菌细胞膜完整性而进入胞内，通过抑制DNA和RNA合成来达到杀菌效果，例如抗菌肽microcin B17[14]、抗菌肽buforin II[15]均具有抑制DNA复制的功能。大多数抗菌肽可以通过多靶位发挥抑菌作用，如抗菌肽P-1可引起粉红单端孢细胞膜通透性增加，抑制蛋白质及核酸合成，导致菌体代谢紊乱，进而达到抑菌作用[16]。因此，本研究将从细胞膜质子动力势、细胞膜完整性、细胞膜代谢活力、细胞超微结构、蛋白质以及核酸合成等方面研究抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌的联合抑菌机理，以期为抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸在食品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC 25923）河北科技大学食品生物技术与安全实验室保藏；抗菌肽brevilaterin 河北科技大学食品生物技术与安全实验室制备[17]。

ε-聚赖氨酸 上海麦克林生化科技有限公司；DiSC3(5)、BCECF-AM 美国Sigma公司；红四氮唑上海源叶生物科技有限公司；正丁醇 天津市永大化学试剂有限公司；LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒 美国Thermo Fisher Scientific公司；低分子质量蛋白Marker、DNA Ladder 北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司；Agarose G-10 法国Biowest公司。

1.2 仪器与设备

Evolution 220型紫外分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；F-7000-FL型荧光分光光度计、H-7650型透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；Accuri C6 plus型流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；BX53型荧光显微镜 日本奥林巴斯株式会社； Gel Doc XR+型凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组

所有实验均按抑菌剂种类和终浓度将实验分为6 组，即2 个抗菌肽组（MIC和1/4 MIC）、2 个ε-聚赖氨酸组（MIC和1/4 MIC）、联用组（1/4 MIC抗菌肽brevilaterin+1/4 MIC ε-聚赖氨酸）、对照组（未添加抑菌剂）。

1.3.2 抑菌动力学的测定

将对数期金黄色葡萄球菌菌悬液（106CFU/mL）与等体积不同抑菌剂水溶液混合，使抗菌肽brevilaterin组终浓度分别为MIC、1/4 MIC，ε-聚赖氨酸组的ε-聚赖氨酸组终浓度分别为MIC、1/4 MIC，联用组抗菌肽brevilaterin、ε-聚赖氨酸的终浓度均为1/4 MIC，以质量分数0.85%生理盐水作为对照组。在37 ℃培养箱孵育，定时取出。取稀释好的菌悬液100 μL进行平板涂布，37 ℃孵育24 h后进行菌落计数。

1.3.3 质子动力势的测定

将对数期金黄色葡萄球菌用5 mmol/L Hepes缓冲液（含10 mmol/L葡萄糖、100 mmol/L氯化钾，pH 7.2）清洗、重悬，加入DiSC3(5)荧光探针（终浓度为1 μmol/L），并于30 ℃避光孵育15 min。在比色皿中加入菌悬液（终浓度为108CFU/mL）与等体积的抑菌剂，以缬氨霉素（Valinomycin，Val）作为阳性对照、尼日利亚菌素（Nigericin，Nig）为阴性对照，终浓度均为1 μmol/L。使用荧光分光光度计进行时间扫描，其中激发波长为650 nm，发射波长为672 nm。

将对数期金黄色葡萄球菌用10 mmol/L葡萄糖溶液（pH 6）清洗、重悬为3×108CFU/mL，加入BCECF-AM荧光探针（终浓度1 µmol/L），于30 ℃避光孵育20 min。菌悬液与抑菌剂按体积比1∶1混合，以Nig作为阳性对照，Val作为阴性对照（终浓度均为5 µmol/L），使用荧光分光光度计在激发波长502 nm、发射波长525 nm处进行时间扫描。

1.3.4 呼吸链脱氢酶活力的测定

参考冯建岭[18]的方法，通过测定抑菌剂作用后细胞膜呼吸链脱氢酶的变化研究金黄色葡萄球菌细胞代谢活力。向具塞试管中分别加入1 mL对数期菌液，Tris-HCl缓冲液（pH 8.6、0.05 mol/L）、葡萄糖溶液（0.1 mol/L）以及红四氮唑（1 mg/mL）各2 mL，充分摇晃均匀。然后加入1 mL抑菌剂，以无菌水作为对照组，37 ℃孵育5 h后滴加两滴浓硫酸终止反应。最后向试管中加入5 mL正丁醇振荡萃取，然后静置8 min，测量上层液体于490 nm波长处的吸光度。

1.3.5 细胞膜完整性的测定

将对数期金黄色葡萄球菌用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L、pH 7.2）清洗、重悬。菌悬液（终浓度为108CFU/mL）与不同浓度抑菌剂等体积混合。在37 ℃条件下培养1 h后用PBS清洗、重悬。加入荧光染料SYTO 9和碘化丙啶（propidiumiodide，PI），使其终浓度均为2 μmol/L，30 ℃条件下避光孵育15 min，用PBS清洗、重悬后，分别采用流式细胞仪和荧光显微镜对染色细胞进行计数分析与观察拍照。

1.3.6 菌体超微结构的观察

将对数期金黄色葡萄球菌用PBS（0.01 mol/L、pH 7.2）清洗、重悬后，分别向菌悬液（终浓度为2×108CFU/mL）中加入各抑菌剂。37 ℃下培养1 h后，采用PBS清洗两遍，然后用体积分数4%戊二醛4 ℃固定过夜。之后，再用体积分数1%锇酸在4 ℃固定3 h，用不同体积分数（30%、50%、70%、80%、90%）的丙酮溶液逐级脱水后，再用无水丙酮置换两次。用包埋剂包埋、聚合后进行超薄切片，采用醋酸双氧铀进行染色后，使用TEM观察拍照。

1.3.7 菌体蛋白质合成的测定

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白，具体参考Ning Houqi等[19]的方法，并进行适当修改。将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌用生理盐水清洗、重悬后与抑菌剂混合（菌悬液终浓度为3×108CFU/mL）。在37 ℃条件下孵育4 h后，用生理盐水清洗、重悬至75 µL加入4×蛋白上样缓冲液，在100 ℃沸水中加热5 min后，取出放至室温25 ℃。安装好电泳装置后，于上样孔中加入10 μL样品，调电压至80 V开始电泳，待溴酚蓝进入分离胶后120 V跑至胶底。将胶块放置于染色液（包括1 g/L考马斯亮蓝G250和45%（体积分数，下同）甲醇、10%冰醋酸、45%蒸馏水）中摇床染色20 min后，放入脱色液（包括10%甲醇、10%冰醋酸、80%蒸馏水）中进行摇床脱色，直至条带清晰后使用凝胶成像仪拍照记录结果。

1.3.8 菌体DNA的测定

采用DNA试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，使用超微量紫外分光光度计测定所提DNA的质量浓度（48 µg/mL）和纯度（OD260nm/OD280nm＝1.89）。制备质量分数0.8%的琼脂糖凝胶，其中加入4S Red Plus 核酸染色剂（终浓度为0.1 µL/mL）。将DNA（终质量浓度为12 µg/mL）与各浓度抑菌剂混合，在37 ℃下水浴30 min后，进行琼脂糖凝胶阻滞电泳并使用凝胶成像仪拍照观察。

1.4 数据处理与统计分析

所有实验均重复3 次取其平均值。采用Origin 8.0软件通过单因素方差分析法对实验结果进行统计分析并作图，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对金黄色葡萄球菌的抑菌动力学结果

图 1 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对金黄色葡萄球菌数的影响Fig. 1 Time-kill curves of brevilaterin and/or ε-polylysine against S. aureus

基于前期抗菌肽brevilaterin和ε-聚赖氨酸协同抑菌效应的评价结果[4]，选取1/4 MIC抗菌肽brevilaterin和1/4 MIC ε-聚赖氨酸进行复配并考察两者的协同抑菌动力学。由图1可以看出，MIC抗菌肽brevilaterin、MIC ε-聚赖氨酸以及联用组（1/4 MIC抗菌肽brevilaterin和1/4 MIC ε-聚赖氨酸）均能够抑制金黄色葡萄球菌的生长，且联用组的活菌数明显低于1/4 MIC抗菌肽brevilaterin和1/4 MIC ε-聚赖氨酸单独使用组的活菌数，结果进一步证实了抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸的协同抑菌效果。

2.2 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌细胞膜质子动力势的影响

质子动力势由跨膜电势和跨膜pH值梯度构成，参与ATP合成、活性离子转运、蛋白磷酸化等多种生物学过程[20-21]。DiSC3(5)是一种膜电位敏感探针，在正常细胞中处于自猝灭状态；当膜电位被改变时，DiSC3(5)会释放到介质中，荧光强度增加[22]，因此采用荧光探针DiSC3(5)考察了抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对细胞跨膜电位的影响。结果表明，MIC抗菌肽brevilaterin处理后DiSC3(5)荧光强度迅速增加（图2A），说明其对细胞跨膜电位有较大影响，且作用效果与阳性对照Val类似。MIC ε-聚赖氨酸、1/4 MIC ε-聚赖氨酸、1/4 MIC抗菌肽brevilaterin对膜电位没有明显影响，联用组的荧光强度稍高于单个组分处理组。结果表明，抗菌肽brevilaterin会破坏金黄色葡萄球菌跨膜电势，ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌跨膜电势无明显影响。

BCECF-AM进入细胞后被细胞内的酯酶水解为BCECF留在细胞内，在适当pH值下可被激发产生荧光，且细胞内pH值越高，BCECF探针的荧光强度越强[23]。因此，采用荧光探针BCECF-AM研究了抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌跨膜pH值梯度的影响。Nig可破坏细胞膜的跨膜pH值梯度，以其作为阳性对照，Val对细胞膜跨膜pH值梯度无影响，以其作为阴性对照[24]。如图2B所示，1/4 MIC ε-聚赖氨酸、MIC ε-聚赖氨酸以及联用组的荧光强度变化较大，1/4 MIC抗菌肽brevilaterin、MIC抗菌肽brevilaterin组的BCECF荧光强度没有明显变化。结果表明，ε-聚赖氨酸会破坏金黄色葡萄球菌的跨膜pH值梯度，而抗菌肽brevilaterin对金黄色葡萄球菌的跨膜pH值梯度无明显影响。

图 2 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌质子动力势的影响Fig. 2 Effect of brevilaterin combined with ε-polylysine on transmembrane proton potential of S. aureus

2.3 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对细胞膜完整性的影响

利用PI/SYTO 9荧光探针检测抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对细胞膜完整性的影响[25]。SYTO 9探针通常会标记群体中的所有细菌，而PI只能标记细胞膜受损的细菌。当两种探针同时存在时，PI会与SYTO 9发生竞争性结合，导致SYTO 9染色荧光减少。流式细胞仪（图3、4）结合荧光显微镜图（图5）结果显示，对照组（膜破损率为9.4%）与1/4 MIC ε-聚赖氨酸（膜破损率为10.4%）几乎全部发出绿色荧光，而经过MIC抗菌肽brevilaterin处理后的细胞因为膜破损较严重（膜破损率高达97.3%），PI与SYTO 9发生竞争性结合颜色呈橙红色。1/4 MIC抗菌肽brevilaterin、MIC ε-聚赖氨酸以及联用组处理后，检测到部分红色荧光，说明部分细胞膜受损（破损率分别为36.3%、22.6%、51.3%），MIC抗菌肽brevilaterin组检测到大量红色荧光，几乎没有绿色荧光，说明细胞膜的破损较严重。结果表明，MIC抗菌肽brevilaterin可以完全破坏细胞膜完整性，而MIC ε-聚赖氨酸仅造成部分膜完整性损伤，联用组对膜完整性的破坏程度约等于抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸二者的加和，说明1/4 MIC抗菌肽brevilaterin与1/4 MIC ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌膜完整性的破坏作用具有叠加性。

图 3 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸作用于金黄色葡萄球菌的流式细胞图Fig. 3 Effect of brevilaterin combined with ε-polylysine on flow cytometry analysis of S. aureus

图 4 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌细胞膜完整性的影响Fig. 4 Effect of brevilaterin combined with ε-polylysine on membrane integrity of S. aureus

图 5 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸作用于金黄色葡萄球菌的荧光显微镜图Fig. 5 Effect of brevilaterin combined with ε-polylysine on membrane integrity of S. aureus evaluated by fluorescence microscopy

2.4 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对细胞膜代谢活力的影响

图 6 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌呼吸链脱氢酶的影响Fig. 6 Effects of brevilaterin and ε-polylysine on respiratory chain dehydrogenase activity of S. aureus

通过测定呼吸链脱氢酶活性来研究抑菌剂对细胞膜代谢活力的影响[26]。红四氮唑进入细胞后会被呼吸链脱氢酶还原为红色的三苯甲臢，根据其含量确定呼吸链脱氢酶的活力。如图6所示，1/4 MIC抗菌肽组的吸光度与对照组相比大幅降低，MIC抗菌肽组的吸光度最低，1/4 MIC ε-聚赖氨酸与MIC ε-聚赖氨酸组的吸光度均显著高于对照组，联用组的吸光度均低于抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸二者单独使用。结果表明抗菌肽brevilaterin对呼吸链脱氢酶有明显抑制作用，而ε-聚赖氨酸对呼吸链脱氢酶无抑制作用。

2.5 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对菌体超微结构的影响

图 7 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌超微结构影响的透射电镜图Fig. 7 Changes in ultrastructure of S. aureus treated with brevilaterin and ε-polylysine

从图7可以看出，对照组菌体细胞壁和细胞膜无破损，内容物完整；1/4 MIC抗菌肽brevilaterin、MIC抗菌肽brevilaterin处理后细胞表面均出现破损（箭头1），MIC组破损较严重；1/4 MIC ε-聚赖氨酸处理后小部分细胞出现轻微破损；MIC ε-聚赖氨酸处理后细胞边缘模糊，部分细胞表面出现破损，细胞质密度均有所降低（箭头2）；联用组的细胞发生变形破裂（箭头3），且细胞内容物发生泄漏导致细胞质密度降低（箭头4）。上述结果表明抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用可协同破坏壁和细胞膜，导致内容物泄漏。结果中ε-聚赖氨酸对细胞超微结构的影响与Hyldgaard等[27]研究的经ε-聚赖氨酸处理后的大肠杆菌细胞变化情况相似，均能使细胞发生形变、细胞内容物发生泄露。

2.6 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对细胞蛋白合成的影响

图 8 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌蛋白质合成的影响Fig. 8 Effect of brevilaterin combined with ε-polylysine on protein synthesis in S. aureus

从图8可以看出，抗菌肽brevilaterin处理后的蛋白质条带与对照组相比无明显变化；MIC ε-聚赖氨酸处理后蛋白质条带整体灰度变浅，说明蛋白质浓度降低，且在分子质量小于14.4 kDa处，1/4 MIC ε-聚赖氨酸、MIC ε-聚赖氨酸、联用组处理后蛋白质条带灰度加深。上述结果表明，ε-聚赖氨酸对大分子蛋白质的合成有抑制作用或者是能将大分子蛋白质降解为小分子蛋白质。韩晴[28]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳研究了ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌蛋白质合成的影响，也发现ε-聚赖氨酸能够造成小于14.4 kDa处蛋白质条带灰度加深。

2.7 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对菌体DNA的影响

图 9 抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用对金黄色葡萄球菌DNA的影响Fig. 9 Effect of brevilaterin combined with ε-polylysine on DNA of S. aureus

如图9所示，与对照组相比，抗菌肽brevilaterin作用后的菌体DNA条带无明显变化；1/4 MIC、MIC ε-聚赖氨酸以及联用处理后，DNA均滞留于上样孔，可能是因为电荷的电性发生改变，也可能是因为DNA双螺旋结构发生改变，从而影响DNA迁移率[29]。周祺等[7]研究ε-聚赖氨酸与肠球菌DNA的结合能力时，发现ε-聚赖氨酸与肠球菌DNA有较强的结合能力，可通过与DNA结合进而破坏DNA的功能；Liu Hongxia等[30]也证实了ε-聚赖氨酸与DNA之间具有结合作用。

3 结 论

抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌具有协同抑菌效应。抗菌肽brevilaterin可通过消散细胞跨膜电势，增加细胞膜通透性，破坏细胞膜完整性，进入细胞内从而抑制呼吸链代谢活力最终抑制菌体生长。ε-聚赖氨酸可通过破坏跨膜pH值梯度，增加细胞膜通透性，进入胞内抑制细胞蛋白质合成（或者降解蛋白质），与DNA结合从而抑制细菌生长。抗菌肽brevilaterin与ε-聚赖氨酸联用兼具两者单独作用的抑菌机理，即可通过影响跨膜pH值梯度，增加细胞膜通透性，破坏细胞膜完整性，抑制呼吸链代谢活力，与DNA结合影响蛋白质合成从而发挥协同抑菌作用。