Tim-3在食管癌中的表达及其临床意义*

张 季 邹陈蔚 仓 慧 高 昳 徐依人 潘 虹 刘鹏飞&

徐州医科大学江阴临床学院消化内科1(214400) 南通大学附属江阴医院消化内科2

背景：食管癌是全球癌症死亡的主要原因之一。研究表明，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)可促进肿瘤免疫逃逸，与多种恶性肿瘤的进展和预后不良密切相关。目的：研究Tim-3在食管癌变过程中的表达并探讨其临床意义。方法：收集103例食管癌、21例食管高级别上皮内瘤变、16例食管低级别上皮内瘤变和20例食管慢性炎组织的病理蜡块，采用免疫组化方法检测Tim-3表达；分析Tim-3表达与食管癌临床病理特征的关系。结果：从食管慢性炎、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变至食管癌组织，Tim-3表达水平呈上升趋势(0.271±0.138、0.368±0.198、0.443±0.147、0.639±0.119, P<0.05)。Tim-3表达与食管癌浸润程度、区域淋巴结转移和TNM分期显著相关(P<0.05)，与患者性别、年龄和肿瘤部位无明显相关性(P>0.05)。结论：Tim-3在食管癌变过程中表达升高，食管癌组织中Tim-3过表达与肿瘤进展密切相关。Tim-3可能成为评估食管癌发生、发展和预后的重要生物学标志物。

食管癌是在全世界范围内高发的恶性肿瘤之一，根据GLOBOCAN 2018数据，全球食管癌年新发病例数约为57.2万，占全球新发癌症病例总数的3.16%，年死亡病例数约为50.86万，占全球癌症死亡病例总数的5.32%[1]。早期食管癌症状多不明显，甚至没有任何症状，待出现进行性吞咽困难症状时，肿瘤多已进展至中晚期，常伴有淋巴结转移或周围组织浸润，给后续治疗带来极大的挑战。

T细胞介导的免疫应答是机体抗肿瘤免疫的基础。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3, Tim-3)为Tim家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，最早被认为是一类特异性表达于分化成熟的Th1细胞表面的抑制性分子[2]。作为一种免疫检查点分子，Tim-3可介导T细胞失能和耗竭，促进肿瘤免疫逃逸、侵袭和转移，从而影响患者预后和转归[3-4]。关于Tim-3与恶性肿瘤的一系列研究发现，Tim-3高表达于多种恶性肿瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤细胞甚至外周血中，包括非小细胞肺癌[5]、胃癌[6]、肝细胞癌[7]、结直肠癌[8]、骨肉瘤[9]、宫颈癌[10]、乳腺癌[11]等，并与肿瘤进展和预后不良密切相关，被认为是一种新的肿瘤标志物和潜在的肿瘤免疫治疗靶点。本研究采用免疫组化方法检测Tim-3在食管癌变过程中不同病变阶段的表达，分析其表达与食管癌临床病理特征的关系，以期为食管癌的诊治和预后判断提供新的思路和依据。

材料与方法

一、标本来源

连续收集徐州医科大学江阴临床学院2012—2020年经手术标本病理或内镜活检病理诊断为食管癌或食管上皮内瘤变的患者，所有患者均未接受放疗、化疗或免疫靶向治疗。排除标准：①严重外伤手术患者；②系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病；③严重肝肾功能不全；④其他器官系统恶性肿瘤或癌前病变；⑤病例资料不完整。选取同期经内镜活检病理诊断为食管慢性炎的患者20例作为对照组。研究方案通过徐州医科大学江阴临床学院医学伦理委员会审核批准，入选病例对标本和病例资料的使用知情同意。

二、Tim-3表达检测

取得入选病例的病理蜡块，采用免疫组化PV二步法(PV-9001兔二步法检测试剂盒，二抗为增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，北京中杉金桥生物技术有限公司)检测Tim-3(Tim-3兔多克隆抗体，Abcam plc.)表达。细胞出现棕黄色或棕褐色颗粒为Tim-3表达阳性。使用ImageJ软件分析Tim-3表达的积分光密度值。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料

共103例食管癌患者和37例食管上皮内瘤变患者纳入研究，低级别上皮内瘤变16例，高级别上皮内瘤变21例。参照国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合会(AJCC)发布的第8版食管和食管胃交界部癌临床分期标准[12]，103例食管癌患者中TNM Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为34例、29例、19例和21例。20例食管慢性炎患者中标本源自食管上段2例，中段5例，下段13例。四组间性别构成差异有统计学意义(χ2=11.224,P=0.011)，年龄差异无统计学意义(H=7.172,P=0.067；表1)。

表1 不同食管病变患者一般资料比较

二、Tim-3在食管癌组织中过表达

免疫组化染色显示，各食管病变组织中均可见Tim-3表达，食管癌组织中阳性染色细胞主要是肿瘤浸润淋巴细胞，阳性颗粒主要定位于细胞质。各组Tim-3表达的积分光密度值分析显示，从食管慢性炎、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变至食管癌组织，Tim-3表达水平呈上升趋势，总体差异有统计学意义(0.271±0.138、0.368±0.198、0.443±0.147、0.639±0.119,F=57.609,P<0.001；图1)。进一步的两两比较显示，食管癌组织中的Tim-3表达水平与食管慢性炎和低级别、高级别上皮内瘤变相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

A：食管慢性炎；B：食管低级别上皮内瘤变；C：食管高级别上皮内瘤变；D：食管癌

三、Tim-3表达与食管癌临床病理特征的关系

根据不同临床参数将食管癌患者分组，组间Tim-3表达比较见表2。分析显示，肿瘤浸润程度为T3-4期(癌症侵犯食管纤维膜至食管周围结构)的患者Tim-3表达水平高于肿瘤浸润程度为T1-2期(癌症侵犯黏膜固有层、黏膜肌层、黏膜下层至肌层)的患者，有区域淋巴结转移的患者Tim-3表达水平高于无区域淋巴结转移的患者，TNM Ⅲ-Ⅳ期患者Tim-3表达水平高于TNM Ⅰ-Ⅱ期患者，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同性别、年龄、肿瘤部位分组间Tim-3表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 食管癌组织Tim-3表达与肿瘤临床病理特征的关系

讨 论

肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment)在肿瘤进展中起着至关重要的作用，其中包含肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)等多种免疫细胞，免疫抑制是肿瘤免疫微环境的主要特征之一[13]。Tim-3是新近鉴定的免疫检查点分子，起有负性调控机体免疫功能的作用，可表达于Th1细胞、Th17细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞，甚至NK细胞、树突细胞、肥大细胞、肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞以及多种实体瘤细胞表面。Tim-3在免疫细胞和肿瘤免疫微环境中高表达，阻碍免疫活性细胞增殖、活化并诱导其凋亡，从而使肿瘤细胞出现免疫逃逸现象，与肿瘤临床分期和转移密切相关[3-4]。在效应T细胞(如Th1细胞)中，Tim-3与其配体半乳凝素-9(galectin-9)结合可诱导T细胞凋亡和增殖抑制；体内实验中，给予galectin-9可致产生干扰素-γ(IFN-γ)的细胞选择性缺失，T细胞免疫功能受抑[14]。癌胚抗原细胞黏附分子1(CEACAM1)是Tim-3的另一个配体分子，活化T细胞表面的Tim-3与CEACAM1共表达并形成异二聚体，发挥免疫抑制功能，造成T细胞耗竭和免疫耐受；在小鼠结直肠癌模型中，阻断Tim-3和CEACAM1表达可增强抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤细胞的消除[15]。现已发现Tim-3及其配体在包括食管癌在内的多种恶性肿瘤中呈过表达，肿瘤患者外周血中也可检测到Tim-3阳性细胞比例增高，高表达的Tim-3与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为以及肿瘤临床分期较晚和患者预后不良密切相关[5-11,16]。

Zheng等[16]的研究发现，食管癌组织中浸润的NK细胞Tim-3表达显著上调，并呈现功能障碍表型，肿瘤浸润NK细胞Tim-3高表达与肿瘤侵袭、淋巴结转移以及较晚的临床分期相关。由此推测Tim-3与食管癌进展密切相关，可能成为肿瘤进展的评估指标。本研究采用免疫组化方法检测Tim-3在食管癌变过程中不同病变阶段的表达，发现从食管慢性炎、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变至食管癌，Tim-3表达呈上升趋势。进一步分析Tim-3表达与食管癌临床病理特征的关系，结果显示其表达与肿瘤局部浸润程度、区域淋巴结转移和TNM分期呈显著正相关，T3-4期、N1期和TNM Ⅲ-Ⅳ期食管癌患者肿瘤组织中的Tim-3表达水平显著高于T1-2期、N0期和TNM Ⅰ-Ⅱ期患者。Tim-3表达与患者的性别(男、女性)、年龄(中青年和老年)、肿瘤部位(食管上段、中段和下段)无明显相关性。上述结果在Zheng等[16]研究的基础上进一步提示Tim-3与食管癌变和肿瘤进展有关，为食管癌发生、发展以及预后评估提供了新的临床思路和依据。

综上所述，Tim-3在食管癌变过程中表达升高，食管癌组织中Tim-3过表达与肿瘤侵袭、转移和临床分期密切相关，提示Tim-3可能成为评估食管癌发生、发展和预后的重要生物学标志物。本研究的不足之处主要在于未追踪随访入选病例的生存信息以进一步分析Tim-3表达与预后的相关性，后续研究拟扩大样本量、采集患者生存信息以弥补此缺陷。