外泌体环状RNA对结直肠癌早期筛查的临床价值

贾一鑫 孟立娜

浙江中医药大学附属第一医院消化内科(310006)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大可表现为排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现为贫血、体质量减轻等全身症状。外泌体是一种可由任何类型细胞释放的纳米级膜性囊泡，内含蛋白质、脂质和核酸等物质，其由多囊泡与细胞膜融合后被释放至细胞外。作为一种信号传递分子，外泌体可将含有生物信息的内容物传送至靶细胞，发挥特定作用。环状RNA(circRNA)可稳定存在并随外泌体释放于血清中。近来，越来越多的研究表明，circRNA与CRC的发生、发展以及预后存在密切联系。通过检测血清circRNA对CRC进行早期筛查可能具有重要的临床价值。本文就外泌体circRNA对CRC早期筛查的临床意义作一综述。

一、CRC的发病现状

在全球范围内，CRC的发病率居男性肿瘤的第2位，约占10.9%；居女性的第3位，约占9.6%[1]。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)的研究[2]显示，2018年全球CRC新发病例共185.0万例，约占全球恶性肿瘤的10.2%，为第3位最常见的恶性肿瘤。临床上对CRC的筛查手段主要为检测血清肿瘤标志物如CEA、CA19-9、CA50以及结肠镜检查等，但目前血清肿瘤标志物检测CRC的敏感性和特异性均不甚理想。因此亟待探寻一种安全高效、能在人群中普及的CRC早期筛查新方法。目前大量研究[3-8]结果表明，外泌体circRNA可能在CRC的发生、发展、演变、转移等方面起有至关重要的作用，因此检测外泌体circRNA有望成为CRC早期筛查的新方法。

二、外泌体的概述

外泌体是一种由多囊泡胞内体(multivesicular endosome, MVE)与细胞膜融合后向胞外分泌的、直径30～150 nm的小囊泡，可作为“信使”参与细胞间信息调控[9]。外泌体可从全身大多数细胞脱落，并存在于体液(血液、汗液、尿液、唾液、母乳、脑脊液等)中，提示其可能参与诸多生理或病理过程[10]。研究[11]显示circRNA在外泌体富集且稳定存在，并可随外泌体出现于血液中。

三、CircRNA的生物学起源和特性

CircRNA是一类内源性非编码RNA，具有闭合环状结构，缺乏传统线性RNA的5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾，长度不一，早前生物学家普遍认为其是剪接错误的结果[12]。随着高通量测序等技术的发展，大量circRNA被发现，显示出独特的生物学特性，主要包括以下几个方面：①含量多，种类多。 目前在真核生物和原核生物中均发现了数量繁多的circRNA；②高稳定性：由于不具有5’帽端和3’尾端的闭合环状结构，因此可不受核酸外切酶的影响而稳定存在[13]；③高保守性：研究[14]发现人类的某些circRNA与一些昆虫的circRNA有相似的序列；④高表达：采用高通量测序发现，在某些疾病中，部分circRNA大量表达，甚至可多于线性RNA的表达[13]。研究[15]表明CRC会分泌大量circRNA进入血循环。上述特性使circRNA有望成为CRC早期筛查的生物学指标。

四、CircRNA的功能

CircRNA与生物的生长发育、疾病的发生发展等密切相关，并在作为预测、诊断疾病标志物等方面的应用前景十分广阔，但其生物学功能仍未完全阐明。目前较为明确的circRNA生物学功能主要包括：①充当微小RNA(miRNA)的海绵体：circRNA上存在大量miRNA结合位点，可通过海绵吸附作用与miRNA 相互结合，抑制miRNA表达，进而调控细胞内信号转导通路[16]。②转录调控作用：研究[12]发现，一些circRNA可与RNA聚合酶Ⅱ相互作用，进而影响宿主的基因转录。③调节基因表达：circRNA可与调节mRNA的结合蛋白结合，从而调节基因表达。④翻译作用：circRNA虽属于非编码RNA，但部分circRNA含有大量编码链，可介导蛋白质翻译[17]。

五、CircRNA与CRC

近年研究已明确circRNA参与诸多疾病的发生和发展，包括心血管疾病、呼吸系统疾病、肿瘤疾病等。其中，circRNA与CRC的关系备受关注。

1. CircRNA在CRC中的表达：Bian等[18]的研究显示，CRC组织中hsa_circRNA_103809表达下调，并促进CRC细胞周期从G0/G1期向S期转化，进而抑制细胞凋亡，敲除该circRNA则可显著促进CRC细胞的增殖和迁移。作为抑癌因子，hsa_circRNA_103809可能通过miR-532-3P/FOXO4轴参与CRC的生物学过程。Wang等[19]的研究发现，hsa_circ_0000567在CRC组织和CRC细胞株中的表达均显著下调。Hsa_circ_0000567表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移呈负相关，提示其可抑制CRC的发生、发展、转移等过程。ROC曲线示hsa_circ_0000567诊断CRC的AUC为0.865 3，表明 hsa_circ_0000567对CRC具有较高的敏感性和特异性。Fang等[20]对44例CRC组织及其邻近非癌组织分析后发现，circRNA_100290在CRC组织中表达上调，且在有转移灶的组织中上调更为显著。进一步将其沉默后，CRC细胞的侵袭和转移能力显著降低，表明circRNA_100290可能参与了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭过程。Guo等[6]的研究发现，CRC组织中hsa_circ_0000069高表达，体外敲除该RNA可明显诱导CRC细胞周期阻滞。Xie等[8]在12对匹配的正常和CRC样本中发现了85个差异表达的circRNA，并选择hsa_circ_001569作为潜在的CRC进展调控因子，结果发现hsa_circ_001569作为miR-145的海绵，通过抑制miR-145的转录活性，明显促进CRC细胞增殖和侵袭。上述研究证实circRNA在CRC的发生、发展过程中发挥调控作用。

2. 外泌体circRNA诊断CRC：有研究[11]发现，circRNA在外泌体中富集并随外泌体出现于血清中，可成为CRC早期筛查的生物学标志物。Lin等[21]的研究结果显示，3种circRNA(circ-CCDC66、circ-ABCC1以及circ-STIL)在CRC患者血浆中的表达均显著下降。这3个circRNA组合成的3环RNA集合较单个RNA筛查CRC的特异性、敏感性更高，优于传统的生物蛋白标志物。CEA阴性的CRC患者3环RNA集合的AUC为0.775，对CA19-9阴性CRC患者的AUC为0.778，表明3环RNA集合可用于早期筛查CEA或CA19-9水平正常的CRC患者。将circRNA集合与CEA和CA19-9结合可能会使诊断效能进一步提高。Yang等[22]的研究发现，与健康对照组相比，CRC患者血浆hsa_circ_0002320表达降低。进一步检测CEA和hsa_circ_0002320预测CRC的准确性，发现hsa_circ_0002320诊断CRC的敏感性和特异性均优于CEA，提示血清外泌体hsa_circ_0002320可能较CEA更合适作为CRC的早期预测指标。Zhou等[23]发现，在CRC组织中circCAMSAP1表达丰富，且是上调最为显著的circRNA。对20例术前和术后CRC患者和9例健康志愿者的血清样本进行微滴式数字PCR分析后发现，circCAMSAP1在术前CRC患者血清中富集，表明circCAMSAP1可作为CRC早期诊断的生物学标志物。Xie等[24]将TNM Ⅰ/Ⅱ期的CRC患者视为早期CRC患者，通过ROC曲线分析评估血清外泌体circ-PNN对早期CRC和淋巴结转移的诊断价值。结果发现血清外泌体circ-PNN诊断早期CRC的AUC为0.854，但诊断淋巴结转移的效能较差(AUC为0.544)，因此外泌体circ-PNN可能更适合作为早期CRC诊断的生物学标志物。Dou等[25]的研究对3种CRC细胞株(仅在KRAS突变状态上有所不同)和外泌体中的circRNA表达谱进行比较。在细胞RNA中鉴定了数百种高质量的circRNA候选物，发现其可转移至外泌体中，且在外泌体中趋于丰富。Hon等[26]的研究显示，CRC细胞株和CRC患者血清外泌体中存在circRNA。此外，与KRAS野生型细胞相比，KRAS突变型细胞中circRNA富集水平显著下调，且在KRAS突变型CRC细胞株中发现外泌体circRNA如circFAT1、circARHGAP5以及circHIPK3等差异表达。另一方面，与健康对照者相比，CRC患者血清外泌体中circRNA的种类不同，CRC患者血清外泌体中部分circRNA缺失，且存在新的circRNA如circ_KLDHC10表达。Pan等[27]对135例CRC患者、35例良性肠道疾病患者以及45名健康对照者进行研究，发现hsa_circ_0004771表达在CRC组织中显著下调，但CRC患者血清中的外泌体hsa_circ_0004771显著升高，此差异可能是由circRNA随外泌体分泌至细胞外所致。ROC曲线分析显示，CRC患者循环外泌体hsa_circ_0004771诊断CRC的AUC为0.92，有助于CRC的鉴别诊断。Ye等[28]的研究对CRC患者与健康对照者的血清外泌体比较后发现，两者存在204个差异表达的circRNA，其中26个在CRC患者血浆外泌体中表达下调，178个表达上调。其中CRC术前与术后hsa_circ_0082182、hsa_circ_0000370相比差异有统计学意义，而hsa_circ_0035445无明显差异。ROC曲线示hsa_circ_0000370的AUC为0.815 2，hsa_circ_0082182为0.737 1，hsa_circ_0035445为0.702 8，三者联合的AUC为0.834 7，且敏感性和特异性较检测单个RNA高，提示多种circRNA联合检测可提高CRC的早期筛查率。Zhang等[29]对112例CRC患者和46名健康对照者血清外泌体中的circRNA分析后发现，hsa_circ_0007534表达存在差异，CRC患者hsa_circ_0007534呈高表达，诊断CRC的AUC为0.780，敏感性和特异性分别为0.920和0.522。进一步对CRC患者进行分期，结果显示分期越高，AUC越高，上述结果提示hsa_circ_0007534不仅可作为CRC早期筛查的生物学标志物，亦能为CRC的临床分期提供一定参考。Li等[30]的研究对CRC患者血清外泌体中circRNA进行meta分析后表明，circRNA表达失调是CRC的有效预测指标，AUC为 0.79，加权敏感性为0.77，特异性为0.67，诊断优势比(diagnostic odds ratio, DOR)为7.52。综上所述， circRNA在外泌体中富集和稳定，可作为CRC早期筛查的生物学标志物。

六、小结和展望

近年来，circRNA逐渐引起研究者的重视，对circRNA在肿瘤中的生物学功能和特性的研究取得了显著进展，但仍存在诸多问题未阐明。目前已有研究证实circRNA在CRC的发生、发展中发挥关键作用。由于circRNA含量丰富、稳定性高、具有疾病特异性等生物学特征使其有助于CRC早期诊断。未来还需进一步研究明确外泌体circRNA与CRC的关系以及如何筛选对CRC有筛查意义的circRNA。虽然circRNA对CRC早期筛查的研究处于初始阶段，但随着研究的深入以及高通量测序技术的快速发展，外泌体circRNA有望成为早期筛查CRC的生物学指标。