基于可见光谱参数的烤烟叶片叶绿素含量估算模型

孙志伟 张启明 苑举民 何仲秋 姜斌 闫慧峰 王树声

摘  要：為快速、无损、准确地估计烟草叶绿素含量，通过品种和氮素水平双因素试验，获得叶片数字图像和叶片叶绿素含量数据集，分析叶片可见光谱参数与叶绿素含量参数间的关系并选择最佳参数建立估测模型。结果表明，烤烟品种和氮素水平互作增加了叶绿素与光谱参数的变异性;在3类颜色指标中，NRI、R/（G+B）、（R-B）/G、（G-R）/（R+G+B）、（R-B）/（R+G+B）、ExR与叶绿素指标达到极显著相关（p<0.01），其中R/（G+B）与Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）之间的相关系数分别为-0.632、-0.636、-0.666，相关性表现最好;利用田间试验进行验证，R/（G+B）对叶绿素指标的预测精度最高，与Chl.a、Chl.b、Chl（a+b）之间的均方根误差值分别为0.6069、0.1567、0.7575;选择R/（G+B）作为叶绿素含量估测的最佳颜色指标。利用该方法可实现智能手机对烟草叶绿素含量进行快速测定，及时指导烟田施肥和采取合适的栽培管理措施，具有可期的应用潜力。

关键词：烤烟;可见光谱;叶绿素含量;颜色指标;方程模型

Estimation Model of Chlorophyll Content in Tobacco Based on Visible Spectroscopic Parameters

SUN Zhiwei¹， ZHANG Qiming²， YUAN Jumin²， HE Zhongqiu¹， JIANG Bin³， YAN Huifeng^1*， WANG Shusheng^1*

（1.Tobacco Research Institute of CAAS， Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Qingdao 266101， China; 2. Jiangxi Institute of Tobacco Science， Nanchang 330025， China; 3. Shandong Branch of China National Tobacco Corporation， Jinan 250101， China）

Abstract：In order to estimate the chlorophyll content of tobacco quickly， nondestructively and accurately， the relationship between visible spectral parameters and chlorophyll content parameters was analyzed by designing a two-factor experiment of variety and nitrogen level， and the best parameters were selected to establish the estimation model. The results of nutrient solution culture showed that the interaction between flue-cured tobacco varieties and nitrogen levels increased the variability of chlorophyll and spectral parameters. However， among the three color indices， NRI，R/（G+B）， （R-B）/G， （G-R）/（R+G+B）， （R-B）/（R+G+B） and ExR were significantly correlated with chlorophyll indices （p<0.01）. The correlation coefficients betweenR/（G+B） and Chl.a， Chl.b and Chl（a+b） were -0.632， -0.636， -0.666， respectively， with the best correlation performance. Field experiments confirmed thatR/（G+B） had the highest accuracy in predicting chlorophyll content， and it was chosen as the best color index for estimating chlorophyll content. The RMS errors betweenR/（G+B） and Chl.a， Chl.b and Chl（a+b） were 0.6069， 0.1567 and 0.7575， respectively. With this method， chlorophyll content of tobacco can be rapidly determined by smart phone， and the fertilization and cultivation management measures can be timely guided. It has a promising application potential.

Keywords： flue-cured tobacco; visible spectrum; chlorophyll content; color index; equation model

叶绿素为植物叶片中的吸光物质，是植物和外界发生能量转化的重要条件^[1]。叶绿素与叶片氮浓度、氮肥施用量和产量相关^[2]，因此常常利用叶绿素含量来估测作物氮素的营养状况。叶绿素含量也与叶片颜色有关^[3]，叶色是高等植物常见的可见形态特征，通过叶色的变化可判断作物生长发育情况。

传统的叶绿素含量测定方法有两种，一是进行实验室的化学分析，其优点是能够准确测定叶片中叶绿素含量，缺点是其为破坏性的测定，且需要一定的试验条件，测定耗时较长，不能实现快速测定^[4]。二是用SPAD仪实时测定叶片的SPAD值表征叶绿素含量的相对值，优点是可以实现叶绿素的无损快速测定，但SPAD仪缺点为测定变异性大，需要进行多点测定来降低变异性，且受作物品种和生育期的影响较大，购买SPAD仪价格较贵，生产上推广应用有一定的难度^[5]。

植物光谱诊断是基于植物的光谱特性来反映植物的生理生化特征和化学成分的变化^[6]。植物的光谱特性与叶片结构和色素含量有关，与植物营养状况也密切相关。近年来，科学家进行了大量估测植物叶片叶绿素含量的研究，刑雪霞等^[7]研究表明，光谱参数TCARI与烤烟叶绿素、类胡萝卜素含量有较好的相关性。水稻和冬油菜^[8-9]的研究表明NRI与SPAD值、叶片氮含量之间的相关性达到极显著水平，苏永士等^[10]研究表明，利用高光谱仪获取的GNDVI与烤烟叶绿素含量和叶面积指数有良好的相关性。

以上研究都采用不同手段将数字图像参数与作物营养状况进行了分析。本文旨在研究烟草叶绿素含量与不同颜色特征参数之间的关系，筛选对烟草叶绿素含量的敏感参数，确定烟草叶绿素含量的估算模型，为快速、准确地定量估测烤烟叶片叶绿素含量提供有效的方法，也为烤烟生长状况的实时监测提供技术基础。

1  材料与方法

1.1  试验设计

试验分为营养液培养试验和田间试验两部分进行，营养液试验用于筛选颜色参数，建立估算模型，田间试验用于模型反演，确定估算模型的适用性。

营养液培养试验于2018年7月在中国农业科学院烟草研究所即墨实验基地温室进行。品种和氮水平两因素随机区组设计，烤烟品种为云烟87、NC55、K326和中烟100;氮素水平为低氮处理，对照处理和高氮处理，对应的营养液氮浓度分别为0.2、2、20 mmol/L。待烟苗长至4叶1心时移至营养液培养。每个处理3次重复。完全营养液的组成及浓度为：2.5 mmol/L KCl，2 mmol/L MgSO₄，1 mmol/L KH₂PO₄，0.01 mmol/L H₃BO₃，1 μmol/L MnSO₄，0.25 mmol/L CuSO₄，1 μmol/L ZnSO₄，0.25 mmol/L （NH₄）₆Mo₇O₂₄，0.2 mmol/L Fe-EDTA，0.2 mmol/L FeSO₄。对烟苗移栽后第1片新叶挂牌，取下一片新展开叶，使用手机拍照并测定叶绿素含量。

田间试验于2019年3月至6月在江西省安福县进行，为品种和氮肥用量双因素随机区组试验，烤烟品种为K326与中烟100。氮肥用量分别为0、90、180 kg/hm²。每个处理3次重复。移栽后47 d，取各品种各处理上部完全展开新叶，使用手机拍照并测定叶绿素含量。

1.2  测定项目与方法

1.2.1  叶绿素含量的测定 参考苏永士等^[10]的方法进行。

1.2.2  叶片数字图像的获取与处理  营养液试验及田间试验，取无损的叶片作为待测样品，无风无云的晴天12：00—14：00于室外使用苹果智能手机（iphone XS max）原生相机对叶片拍照，拍照距离固定1 m，角度90°，曝光与白平衡均为自动模式，图片以JPG格式存储，图像分辨率4032*3024像素。获得的照片导入计算机后用Photoshop 14.0软件将叶片图像进行分割，去除背景，仅保留叶片主体部分（不含叶脉），用Photoshop 14.0的直方图程序获取图像颜色参数红光值R（redness intensity）、绿光值G（greenness intensity）和蓝光值B（blueness intensity）。

1.2.3  颜色指标的获取  根据前人研究结果^[7]，选取了归一化颜色指标、比颜色指标和归一化差分颜色指标3类颜色指标类型，其中归一化颜色指标包括NRI=R/（R+G+B）^[11-13]，NGI=G/（R+G+B）^[14-15]，NBI=B/（R+G+B）^[16];比颜色指标包括R/（G+B）^[17]，G/（R+B）^[17]，B/（R+G）^[17]，（R-B）/G^[17-18]，（G-B）/R^[17-18];歸一化差分颜色指标包括（G-R）/（R+G+B）^[19]，（R-B）/（R+G+B）^[17，20]，（G-B）/（R+G+B）^[21]，ExR=（1.4R-G）/（R+G+B）^[19]，（1.4B-G）/（R+G+B）^[19]，（2G-R-B）/（R+G+B）^[19]。

1.3  数据分析方法

1.3.1  氮素营养诊断方程模型验证方法  通过对叶绿素指标的测定和颜色参数的提取，建立颜色指标与叶绿素指标的模型，并选择均方根误差（Root mean square error，RMSE）评价预测值和实测值的拟合效果。均方根误差计算公式为：

1.3.2  数据的处理与分析  图像处理使用Photoshop 8.0，使用Graphpad Prism 6、Microsoft Excel 2016 及SPSS 19进行数据处理及分析。

2  结  果

2.1  烤烟不同品种及不同氮素水平对叶绿素含量的影响

图1表明，在低氮水平下叶绿素含量均较低，随供氮水平升高，中烟100和NC55叶绿素含量随之升高，K326和云烟87在供氮浓度达到2 mmol/L之后不再升高。说明K326和云烟87对氮素水平较为敏感，中烟100与NC55敏感性较差。Chl.a与Chl.（a+b）变化规律一致，Chl.b在不同氮素水平和品种间呈现的差异较小，说明氮素水平对叶绿素含量的影响主要是通过Chl.a实现的。综上，不同氮素水平对叶绿素含量有显著影响且在品种间呈现差异性。

2.2  烤烟叶片叶绿素含量及数字图像颜色参数及其变异性

由表1可知，在不同供氮水平下，不同烤烟品种Chl.（a+b）极值相差较大，Chl.a的次之，Chl.b的相差最小。由两试验的颜色特征参数可知：平均值由大到小顺序为绿光值>红光值>蓝光值，说明烤烟叶片绿光反射量最高，红光次之，蓝光最小。较视觉感官（图2），光谱参数更加精准地反映了叶色

差异。从变异系数可知：颜色指标变异系数由大到小顺序为红光值>绿光值>蓝光值，说明在品种和氮素水平试验中，蓝光值的稳定性较好，属于较稳定的参数，而红光值波动较大，属于敏感参数。另外，叶绿素指标变异系数由大到小顺序为Chl.a>Chl.（a+b）>Chl.b，其中Chl.b最为稳定，Chl.a波动较大。两试验叶绿素指标变异系数均在20%～30%之间，样本均为中等程度变异样本，符合建立方程的数据样本变异要求。

2.3  烤烟冠层图像颜色指标的筛选

由表2颜色指标与叶绿素含量的相关性分析可知，除B/（R+G）、（G-B）/R、NBI、（G-B）/（R+G+B）、（1.4B-G）/（R+G+B）外，其他图像颜色指标均与各叶绿素含量有显著或极显著的相关关系。其中，G/（R+B）、NGI、（2G-R-B）/（R+G+B）与Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）在p<0.05水平显著相关，6个指标在p<0.01水平显著相关，他们相关性大小为R/（G+B）>NRI>ExR> （G-R）/（R+G+B）>（R-B）/G>（R-B）/（R+G+B），除G/（R+B）、NGI、（2G-R-B）/（R+G+B）、（G-R）/（R+G+B）外，均与叶绿素基本指标呈极显著负相关关系。各颜色指标与3个叶绿素指标的相关性基本稳定一致，Chl.（a+b）相关系数均高于Chl.a与Chl.b，与颜色指标的相关性更好。根据与叶绿素含量的相关性大小，在3类颜色指标中分别选取NRI、R/（G+B）、ExR作为预测叶绿素含量的潜在指标。

2.4  烤烟叶绿素含量诊断方程模型检验

本试验选择线性方程来表示营养指标与叶绿素含量之间的关系。验证结果表明，基于颜色指标NRI、R/（G+B）建立的诊断方程模型，叶绿素含量的真实检测值与方程模型预测值均较为吻合，真实检测值分布集中，模型验证精度较高（图3）。经计算NRI、R/（G+B）、ExR与Chl.a的RMSE值分别为0.6069、0.6053、0.8778，NRI、R/（G+B）、ExR与Chl.b的RMSE值分别为0.1567、0.1566、0.2033，

NRI、R/（G+B）、ExR與Chl.（a+b）的RMSE值分别为0.7575、0.7552、1.0749。RMSE反映了预测数据偏离真实值的程度，值越小，表示该模型预测精度越高。3个颜色指标，NRI、R/（G+B）的RMSE明显优于ExR，预测精度最高。R/（G+B）的相对预测效果略优于NRI，用R/（G+B）值分别表示Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）的直线预测方程分别为y=-22.916x+14.353，y=-4.6338x+3.1192，y=-27.549x+17.473。

3  讨  论

营养液试验中，3个颜色参数与叶绿素含量显著相关，6个颜色参数与叶绿素含量极显著相关，其中比颜色指标中的R/（G+B）的相关系数最高，为0.632;研究表明^[22]，颜色指标与叶绿素含量相关性在0.7左右为最优，说明本研究中通过营养液实验构建的可见光谱叶绿素含量估测模型具有可行性。与多数研究者不同^[22-25]，本研究中运用与营养液试验环境完全不同的田间试验来验证叶绿素估算模型，通过相关性分析表明，3个颜色指标NRI、R/（G+B）、ExR的RMSE较小，符合反演要求。其中以颜色指标R/（G+B）为最佳。其他研究也表明，R/（G+B）参数建立的锦橙叶片SPAD值预测模型误差最小^[24]，棉花叶片的Chl.a、Chl.b、Chl（a+b）与R/（G+B）也呈极显著相关关系^[25]。

图像获取需要一定的标准和方法，研究表明^[26]，图片的拍摄角度、拍摄高度、图片储存格式对光谱参数没有影响，但不同光照强度和不同图像分辨率对图片的光谱参数值影响较大。本研究拍摄环境条件下，图片阴影面积较小，对图片处理结果影响较小。在拍摄设备的选择上，选择分辨率较高，统计像素点小而准确的高像素设备拍摄，有效降低分辨率带来的试验误差。图3结果中颜色指标RMSE值较小，精度符合要求，说明模型可以兼容自动白平衡模式下的色温误差。这可能由于颜色参数的比值组合消除了不同环境下色温差异对试验结果的影响，大大降低了该方法在实际田间应用中的操作难度。

利用光谱技术检测作物的营养状况，符合现代

精准农业的要求，有利于改变传统实验室检测叶绿素的方式，缩短检测周期和降低操作难度。但研究取样时期选择为苗期，预测模型在不同生育时期是否适用及如何快速准确地获得叶片颜色指标还需开展进一步的研究。构建的叶绿素含量估算模型，为直接在冠层尺度上应用可见光谱技术提供了理论基础，未来可将试验结果与高空和低空遥感相结合，实现烤烟更高尺度和区域的叶绿素含量检测。另一方面还要继续挖掘叶绿素含量对光谱响应的影响，进一步揭示叶片光谱反射率响应的机理。

4  结  论

通过营养液试验建立的烟叶颜色指标与叶绿素的关系模型在田间试验中得到检验。烟叶叶绿素含量估测的最佳颜色指标为R/（G+B）;Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）的最佳预测方程分别为y=-22.916x+14.353、y=-4.6338x+3.1192、y=-27.549x+17.473。利用数码相机对烟草叶绿素含量进行快速测定，可实现及时指导烟田施肥。叶绿素含量预测模型在烟草不同生育时期是否适用及如何快速准确获得叶片颜色指标还需开展进一步的研究。

参考文献

• 李梦竹，刘国顺，贾方方. 干旱胁迫下旺长期烤烟冠层叶绿素密度的高光谱估测[J]. 中国烟草科学，2017，38（1）：23-28.

LI M Z， LIU G S， JIA F F. Hyperspectral Estimation of Canopy Chlorophyll Density of long-term flue-cured tobacco under drought stress[J]. China Tobacco Science， 2017， 38（1）： 23-28.

• 魏全全，芶久兰，张萌，等. 氮素营养诊断技术的发展及其在冬油菜上的应用[J]. 中国油料作物学报，2019，41（2）：300-308.

WEI Q Q， QI J L， ZHANG M， et al. Development of nitrogen nutrition diagnosis technology and its application in winter rape[J].

Chinese Journal of oil crops， 2019， 41（2）： 300-308.

• 劉伟. 基于叶片颜色特征的棉花部分生理指标的估测[D]. 北京：中国农业科学院，2007.

LIU W. Estimation of some physiological indexes of cotton based on leaf color characteristics[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2007.

• 程立真，朱西存，高璐璐，等. 基于RGB模型的苹果叶片叶绿素 含量估测[J]. 园艺学报，2017，44（2）：381-390.

CHENG L Z， ZHU X C， GAO L L， et al. Estimation of chlorophyll content in Apple Leaves Based on RGB model[J]. Journal of horticulture， 2017， 44（2）： 381-390.

• 张银杰. 基于叶片光谱分析的玉米氮素营养诊断研究[D]. 北京：中国农业科学院，2019.

ZHANG Y J. Study on nutrition diagnosis of corn nitrogen based on leaf spectroscopy[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2019.

• 李佛琳. 基于光谱的烟草生长与品质监测研究[D]. 南京：南京農业大学，2006.

LI F L. Study on tobacco growth and quality monitoring based on spectrum[D]. Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2006.

• 邢雪霞，刘国顺，贾方方，等. 烤烟叶片色素含量的高光谱预测模型研究[J]. 中国烟草学报，2014，20（1）：54-60.

XING X X， LIU G S， JIA F F， et al. Hyperspectral prediction model of pigment content in flue-cured tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（1）： 54-60.

• 王远，王德建，张刚，等. 基于数码相机的水稻冠层图像分割及氮素营养诊断[J]. 农业工程学报，2012，28（17）：131-136.

WANG Y， WANG J D， ZHANG G， et al. Image segmentation and nitrogen nutrition diagnosis of rice canopy based on digital camera[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering， 2012， 28（17）： 131-136.

• 魏全全，李岚涛，任涛，等. 基于数字图像技术的冬油菜氮素营养诊断[J]. 中国农业科学，2015，48（19）：3877-3886.

WEI Q Q， LI L T， REN T， et al. Nutritional diagnosis of nitrogen in winter rapeseed based on digital image technology[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2015， 48（19）： 3877-3886.

• 苏永士，苏富强，王海波，等. 不同施肥条件下烟草冠层光谱特征与叶绿素、叶面积指数的关系[J]. 中国烟草科学，2013，34（2）：23-27.

SU Y S， SU F Q， WANG H B， et al. Relationship between canopy spectral characteristics and chlorophyⅡ， leaf area index under different fertilization conditions[J]. China Tobacco Science， 2013， 34（2）： 23-27.

• 李岚涛，张萌，任涛，等. 应用数字图像技术进行水稻氮素营养诊断[J]. 植物营养与肥料学报，2015，21（1）：259-268.

LI L T， ZHANG M， REN T， et al. Application of digital image technology in nutrition diagnosis of nitrogen in rice[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science， 2015， 21（1）： 259-268.

• 肖焱波，贾良良，陈新平，等. 应用数字图像分析技术进行冬小麦拔节期氮营养诊断[J]. 中国农学通报，2008（8）：448-453.

XIAO Y B， JIA L L， CHEN X P， et al. Application of digital image analysis technique in nitrogen nutrition diagnosis of winter wheat at the onset of node[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2008（8）： 448-453.

• 陈佳悦，姚霞，黄芬，等. 基于图像处理的冬小麦氮素监测模型[J]. 农业工程学报，2016，32（4）：163-170.

CHEN J Y， YAO X， HUANG F， et al. Nitrogen monitoring model of winter wheat based on image processing[J]. Chinese Society of Agricultural Engineering， 2016， 32（4）： 163-170.

• 王娟，雷詠雯，张永帅，等. 应用数字图像分析技术进行棉花氮素营养诊断的研究[J]. 中国生态农业学报，2008（1）：145-149.

WANG J， LEI Y W， ZHANG Y S， et al. Study on nutrition diagnosis of nitrogen in Cotton by Digital Image Analysis[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2008（1）： 145-149.

• 王方永，李少昆，王克如，等. 基于机器视觉的棉花群体叶绿素监测[J]. 作物学报，2007（12）：2041-2046.

WANG F Y， LI S K， WANG K R， et al. Monitoring of chlorophyll in cotton population based on machine vision[J]. Acta Agronomica Sinica， 2007（12）： 2041-2046.

• 张立周，王殿武，张玉铭，等. 数字图像技术在夏玉米氮素营养诊断中的应用[J]. 中国生态农业学报，2010，18（6）：1340-1344.

ZHANG L Z， WANG D W， ZHANG Y M， et al. Application of digital image technology in nutrition diagnosis of nitrogen in summer maize[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2010， 18（6）： 1340-1344.

• 李锦卫. 基于计算机视觉的水稻、油菜叶色-氮营养诊断机理与建模[D]. 长沙：湖南农业大学，2010.

LI J W. Diagnosis mechanism and modeling of leaf color-nitrogen nutrition in rice and rapeseed based on computer vision[D]. Changsha： Hunan Agricultural University， 2010.

• 吴福宁. 图象处理技术在冬小麦氮营养诊断中的应用[D]. 北京：中国农业大学，2004.

WU F N. Application of image processing technique in nitrogen nutrition diagnosis of winter wheat[D]. Beijing： China Agricultural University， 2004.

• 刘勇. 基于无人机平台的小麦冠层叶片氮素营养监测研究[D]. 南京：南京农业大学，2016.

LIU Y. Study on nitrogen nutrient monitoring of wheat canopy leaves based on UAV platform[D]. Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2016.

• 胡昊. 基于可见光_近红外光谱的冬小麦氮素营养诊断与生长监测[D]. 北京：中国农业科学院，2009.

HU H. Nutritional diagnosis and growth monitoring of winter wheat nitrogen based on visible light near infrared spectroscopy[D]. Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2009.

• 刘洪见，曾爱平，郑丽敏. 基于数字图像处理技术的玉米氮肥营养状态诊断[J]. 农业网络信息，2007（12）：31-35.

LIU H J， ZENG A P， ZHENG L M. Diagnosis of nutrition state of corn nitrogen fertilizer based on digital image processing[J]. Agricultural Network Information， 2007（12）： 31-35.

• 柴阿麗，李宝聚，王倩，等. 基于计算机视觉技术的番茄叶片叶绿素含量的检测[J]. 园艺学报，2009，36（1）：45-52.

CHAI A L， LI B J， WANG Q， et al. Detection of chlorophyll content in tomato leaf based on computer visual technology[J]. Journal of Horticulture， 2009， 36（1）： 45-52.

• 钟思荣，龚丝雨，陈仁霄，等. 基于数字图像技术的烟草氮素营养诊断研究[J]. 江西农业大学学报，2017，39（6）：1104-1111. 

ZHONG S R， GONG S Y， CHEN R X. Study on nitrogen nutrition diagnosis of tobacco based on digital image technology[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis， 2017， 39（6）： 1104-1111.

• 易时来，邓烈，何绍兰，等. 锦橙叶片叶绿素含量诊断模型—基于数字图像分析技术[J]. 农机化研究，2011，33（4）：110-115.

YI S L， DENG L， HE S L， et al. Diagnosis model of chlorophyll content in leaves of blue orange： a digital image analysis technique[J]. Journal of Agricultural Mechanization Research， 2011， 33（4）： 110-115.

• 王克如，李少昆，王崇桃，等. 用机器视觉技术获取棉花叶片叶绿素浓度[J]. 作物学报，2006（1）：34-40.

WANG K R， LI S K， WANG C Y， et al. Using machine vision technology to obtain chlorophyll concentration in cotton leaves[J]. Acta Agronomica Sinica， 2006（1）： 34-40.

• 李艳. 加工番茄氮素营养快速诊断方法的研究[D]. 石河子：石河子大学，2007.

LI Y. Study on the rapid diagnosis method of nitrogen nutrition in processing tomato[D]. Shihezi： Shihezi University， 2007.