小鼠肺组织羟脯氨酸含量测定的实验方法优化

陈以文，盛春瑞，刘珊珊，宗晨钟，董瑞娟，葛东宇，王淑艳，李丽娜

0 引 言

羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是一种非必需氨基酸，主要存在于动物的胶原蛋白中，有加强结缔组织的弹性和韧性的作用[1]。通过对组织中羟脯氨酸含量的测定，可以了解机体胶原蛋白分解代谢情况。胶原蛋白的不断积累是纤维化进程的主要病理表现[2]。因此，准确测定肺组织中羟脯氨酸的含量，可以直接有效地判断肺纤维化的发展程度。

目前，在测定HYP含量的众多方法之中，比色法由于操作相对简便，对实验条件要求不高，被广泛采用[3]。由于该方法中每一环节都对反应时间和温度有精确的要求，而现有文献采用的实验方案又往往不具有广泛的样本普适性，因此本文以小鼠肺组织为检测样本，在倪博文的实验基础上研究了碱水解法测定HYP含量的方法及条件[4]。通过对组织水解时间、试剂的氧化时间、显色时间及温度等实验条件的优化，建立一种准确、可靠的小鼠肺组织HYP水平测定方法，效果良好，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物ICR小鼠15只，雄性，体重18～20g，购自北京斯贝福公司，动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。饲养温度(21±2)℃，湿度 40%～70%，光照12 h/d，按清洁级标准适应性饲养5 d。

1.1.2 试剂HYP标准品(WXBB0442V, Sigma公司)，柠檬酸(10007192，国药集团化学试剂有限公司)，柠檬酸三钠(10019418，国药集团上海化学试剂有限公司)，氢氧化钠(080425，北京益利精细化学品有限公司)，氯胺T(20170313，天津市永大化学试剂有限公司)，4-(二甲氨基)苯甲醛(10008714，国药集团化学试剂有限公司)；冰醋酸、甲醇、无水乙醇、异丙醇，均购自北京化工厂(分析纯)，戊巴比妥钠(57-33-0，美国Sigma),注射用盐酸博来霉素(H20055883，浙江，海正辉瑞)。

1.1.3 仪器设备高速冷冻离心机(5714R，德国Eppendorf公司)，Safire2全波长多功能酶标仪(5082，Tecan公司)，电热恒温水箱(HW-W21-600C，北京长风仪器仪表公司)、电热恒温水浴锅(HW-SY11-K,北京长风仪器仪表公司)，生化培养箱(BSP-100，上海博迅)，立式压力蒸汽灭菌器(SM830，重庆雅马拓)。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂制备①HYP标准品样本(10 μg/mL) 将10 mg HYP标准品用 10 mL蒸馏水充分溶解，取1 mL，用蒸馏水稀释至100 mL，-20 ℃避光保存。 ②10 mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液 将4 g NaOH颗粒用 10 mL蒸馏水充分溶解，室温保存。 ③0.1 mol/L柠檬酸缓冲液：将3 g柠檬酸，32.5 g柠檬酸钠用 1 L蒸馏水充分溶解，等分为8份，用10 mol/L 的NaOH溶液和分析纯冰醋酸将pH值分别调至5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，4 ℃保存。④ 0.05 mol/L氯胺T溶液：将4份氯胺T粉末各0.705 g分别用50 mL蒸馏水、甲醇、乙醇、异丙醇充分溶解，4 ℃保存。⑤10% 4-(二甲氨基)苯甲醛(PDAB)溶液：将1 g的PDAB用无水乙醇充分溶解，定容至10 mL，现用现配。 ⑥3.15 mol/L高氯酸溶液：量取浓度为70 %的高氯酸溶液27 ml，用蒸馏水定容至100 mL，常温避光保存。⑦浓度不同的NaOH溶液：分别将1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2 g的NaOH颗粒用蒸馏水充分溶解后，各定容至10 mL，使终浓度分别为3、4、5、6、7、8 mol/L，常温保存。

1.2.2 样本制备①正常小鼠肺组织样本的制备：将麻醉(1 %戊巴比妥钠，40 mg/kg)后的小鼠以仰卧位固定，腹主动脉放血，摘取肺叶并吸去多余血液。称量全肺湿重。湿重肺组织：取1600 mg小鼠肺组织，加入9倍量预冷等渗盐水研磨成匀浆，4 ℃离心10 min(离心半径10 cm，转速12000 r/min)，将上清液保存于 -20 ℃。干重肺组织：称量肺组织净重，放入离心管后再称量毛重， 70 ℃下烘烤至毛重不再减少(约5 h)，室温保存。②博来霉素(bleomycin，BLM)诱导的肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)小鼠肺组织样本的制备：将小鼠麻醉后，按0.5 mg/100g的给药量以气管内注射法制备肺纤维化模型，常规饲养14 d后取材，方法同1.2.2①。

1.2.3 最优实验条件的探索①柠檬酸缓冲液pH值的确定：向各离心管中加入50μL HYP标准品，再分别加入200μL不同pH值的柠檬酸缓冲液和200 μL蒸馏水溶解的氯胺T溶液，37 ℃水浴10 min，随后加入200 μL的高氯酸溶液并混匀， 37 ℃水浴5 min，再加入PDAB溶液200 μL，混匀，管口钻孔，100 ℃水浴加热3 min，冰水浴冷却。各管分别取200 μL加入酶标板，置于酶标仪中于波长560 nm处测定吸光度。HYP测定结果受柠檬酸缓冲液pH值影响波动较大，而当其pH值在6～6.5之间时，HYP测定结果相对稳定。因此，后续实验的最适柠檬酸缓冲液pH值设定为6.5。②氯胺T溶液的溶剂选择及氧化时间的确定：向各离心管中加入50 μL HYP标准品，再分别加入200 μL pH值为6.5的柠檬酸缓冲液，随后分别加入用蒸馏水、甲醇、乙醇、异丙醇配制的氯胺T溶液200 μL，37 ℃水浴，时间分别设置为10、15、20、25、30 min，其余步骤同上。上述4种溶剂配制的氯胺T溶液使得最后的吸光度值不同，总体为：甲醇>乙醇>异丙醇>蒸馏水，且均随反应时间的延长而逐渐下降，至15 min时吸光度值变化趋于平稳。因此，后续实验采用甲醇配制的氯胺T溶液，最佳反应时间设置为15 min。③不同反应条件下对HYP标准品的测定：高氯酸反应时间的不同：将高氯酸溶液的反应时间分别设置为3、5、8、11、14、17、20、25和30 min, 其余步骤同上。PDAB显色温度及时间的不同：确定高氯酸溶液的反应时间后，加入PDAB溶液200 μL，混匀，分别在100 、95、90 、85 ℃水浴1 ～10 min，其余步骤同上。③部分试剂储存时间的不同：用同一批配制的柠檬酸缓冲液、氯胺T溶液和高氯酸溶液，分别于第1、2、3、4、5、6、7天，按照上述实验已确定的最适条件重复实验。每组均设置3个重复样本。碱溶液浓度及水解时间的确定：向装有100 μL肺组织匀浆上清的离心管中分别加入100 μL不同浓度NaOH溶液，使NaOH终浓度为1.5、2、2.5、3、3.5、4 mol/L，经0.1 kPa，121 ℃高温水解，时长分别设置为10、20、30、40、50和60 min，每个时长设置3个重复样本。待恢复至室温后，离心10 min(离心半径10 cm，转速12000 r/min)。取上清液50 μL，按上述实验条件进行。同一碱水解液浓度下，水解时长对HYP测定结果没有明显影响，而碱水解液的浓度则对HYP含量的测定有显著影响(P<0.01)，即肺组织中HYP的测定值与水解液中NaOH的浓度呈负相关。但水解时间与碱水解液浓度之间没有交互作用。当碱水解液浓度为2 mol/L时，HYP测定结果整体相对稳定，并且这一现象在水解时长为10 ～30 min尤为明显。因此碱水解的最佳条件为：NaOH溶液工作浓度为2 mol/L，水解时间为20 min。⑤肺组织干、湿状态对HYP含量测定的影响 将实验1.2.2.1中制备的干燥和湿润肺组织，按照实验1.2.3.4所确定的碱水解条件制得水解液并测定HYP含量，每组设置20个重复样本，对比实验结果。⑥实验方案优化前/后的应用结果对比：将实验1.2.2②中的样本二等分，其中一半用优化前的方案，另一半用优化后的方案，分别测定HYP含量，每组设置5个重复样本，对比实验结果。

1.2.4 标准曲线绘制将 HYP标准品(250 μg/mL)用蒸馏水对倍稀释出7个浓度梯度：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125和3.9 μg/mL，最后1管不加标准品，设为0 μg/mL。之后实验步骤及实验条件按照实验1.2.3的结果进行。

1.2.5 回收实验制备浓度相等的小鼠肺组织碱水解液，并将其分为若干平行管，分别向其中混入1%不同浓度的HYP标准品，之后实验步骤同1.2.3中④，计算回收率。

1.2.6 重复性实验制备浓度相等的小鼠肺组织碱水解液，并将其分为若干平行管，实验步骤同1.2.3中④，批内连续检测5次，批间连续检测3批，分别计算CV。

2 结 果

2.1 高氯酸溶液的不同反应时长对HYP测定结果的影响实验结果显示，随着反应时间的延长，HYP测定结果的吸光度值呈现出先上升，后迅速下降，进而平稳，再陡升陡降的趋势。由于高氯酸的作用是消耗上一步过量添加的氯胺T，使反应液中的吡咯得以与PDAB进行下一步反应，推知此步骤的反应是一个动态过程，因此高氯酸的最适反应时间为该动态过程的第1个峰值点，即5 min。见图1。

2.2 PDAB不同显色温度及时间对HYP测定结果的影响实验结果显示，PDAB反应温度对HYP测定结果有影响，而不同的显色时间能显著影响HYP测定结果(P<0.01)。随着显色时间的延长，4种反应温度下的测定结果均呈现出先迅速上升后缓慢下降的趋势，3 min时集中出现了吸光度的峰值。而在之后的下降趋势中，85 ℃水浴条件下的吸光度值下降速度最缓，在4 min时甚至出现了小幅上升(0.196 9)，其次为90 ℃水浴条件下，而95 ℃和100 ℃水浴条件下的下降幅度更大。当显色时间为3 min时，4种显色温度产生的吸光度值非常接近，分别为0.187 8，0.192 6，0.192 8和0.196 0，说明此时反应温度的改变几乎不影响最终的吸光度值。结果表明，PDAB的最佳显色温度为85 ℃，最佳显色时间为3 min。见图2。

图1 高氯酸不同反应时长下的HYP测定结果

Figure 1 HYP results at different reaction durations of perchloric acid

2.3 部分试剂的不同储存时长对HYP含量测定结果的影响实验结果显示，柠檬酸缓冲液、氯胺T溶液和高氯酸溶液同时在适宜的环境下放置7 d内，对HYP测定结果没有明显影响(P>0.05)，且第3～7 d时结果更为稳定。这表明配制完成后的试剂在适宜的环境下储存7 d，可以保证HYP测定结果稳定。见图3。

图2 PDAB不同显色温度及时长下的HYP测定结果

Figure 2 HYP measurement results at different color temperatures and durations of PDAB

图3 试剂储备不同天数下的HYP测定结果

Figure 3 Results of HYP determination for different days of reagent reserves

2.4 肺组织干湿状态对肺组织HYP含量测定结果的影响实验结果显示，用干燥肺组织测得的HYP含量[(212.26±8.83)mg/g 肺组织]较用湿润肺组织[(162.70±15.04)mg/g 肺组织]高(P<0.01)，且显示前者CV(4.16%)小于后者CV(9.24%)。这表明使用烘干的肺组织进行实验，可获得更高、更稳定的HYP测定结果。

2.5 实验方案优化前/后小鼠肺组织HYP含量的结果对比实验结果显示，用改进后方案测得的肺组织HYP水平([(375.20±6.83)mg/g 肺组织])明显高于使用优化前[(345.99±8.57)mg/g 肺组织]，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.6 标准曲线绘制以HYP标准品浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为y=0.014x+0.073，相关系数为R2=0.999 1，HYP水平为0～250 μg/mL时与吸光度值呈正比关系。见图4。

图4 HYP标准曲线散点图

Figure 4 Scatter plot of standard curve of HYP content

2.7 回收实验回收率分别为118.68%、117.38%和117.88%，均在80%～120%之间，说明本法较为可靠。

2.8 重复性实验批内平均CV为1.11%，批间平均CV为2.30%，说明本法重复性较好。

3 讨 论

肺组织中HYP含量的测定结果被认为是判断肺纤维化进展程度的金指标之一[5]。正常小鼠肺组织中HYP含量较低，往往不超过50 μg/g肺组织[6-10]。因此准确有效的HYP定量检测方法对肺纤维化的基础实验研究有重要意义。

比色法是检测HYP的常用方法之一，其原理为：通过酸溶液或碱溶液水解胶原蛋白样品，释放出HYP，经氯胺T氧化生成吡咯，继而用高氯酸破坏过量的氯胺T，使吡咯与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色复合物，在波长560 nm处，测定其吸光度(A值)[11]。目前国内很多文献应用该方法检测小鼠肺组织HYP含量，但具体实验条件大相径庭。针对胶原蛋白的水解方式主要分为酸水解法和碱水解法，酸水解法水解彻底，但容易破坏部分氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸)；碱水解法相对稳定，操作更安全，水解时间过长同样会损失胶原中的酰胺氮[12]。本实验考察了不同浓度的碱水解液及不同的水解时长对小鼠肺组织中胶原水解程度的影响，结果表明，在0.1 kPa、121 ℃条件下，碱水解液浓度2 mol/L，水解时间为20 min时，HYP测定结果最稳定，这与孔璐等报道的以大鼠肺组织作为样本测得的HYP结果一致[13]。

本实验亦对其他反应条件进行了优化。关于柠檬酸缓冲液pH值对HYP测定结果的影响，经过优化得出的结果为柠檬酸缓冲液pH值应为6～6.5，这亦与孔璐等报道的以大鼠肺组织作为样本摸索出的结果一致[13]。关于氯胺T的溶剂选择及氯胺T溶液的氧化时间，实验结果表明，用甲醇溶解的氯胺T溶液进行测定可获得相对较高的吸光度值，由于小鼠肺组织HYP含量较低，因此氯胺T溶液应选用甲醇配制，且氧化时间应优化为10 min。关于高氯酸溶液的反应时间，实验结果表明，高氯酸溶液参加反应5 min时，HYP测定结果出现峰值，因此这一条件的优化结果应该为5 min。关于PDAB不同显色温度及时间，实验结果表明，当反应时间为3 min时，反应温度在85～100 ℃之间变化对HYP测定结果没有明显影响，且峰值主要集中在此时间点，其中85 ℃的水浴条件可使吸光度值的下降趋势放缓。同时，在实验中我们也观察到，100 ℃水浴时必须在离心管盖钻孔，以防其爆开，95 ℃水浴时虽然可以不必钻孔，但是依然会出现个别管盖爆开，导致管内液体溅出的现象，因此该反应更适宜在相对较低的温度中进行，故优化为85 ℃水浴3 min。这一结果与张茜、彭方毅等的实验结果相比，大大缩短了反应时间，提高了实验效率[14-15]。关于部分试剂不同储存时间，实验结果表明，柠檬酸缓冲液、氯胺T溶液和高氯酸溶液在4 ℃保存7 d，对HYP测定结果基本没有影响，因此在7 d内用同一批配制的上述试剂进行实验，可以认为测得的HYP结果没有发生变化。

关于肺组织的干湿状态，结果显示，用烘干的肺组织测得的HYP含量更高，且结果更稳定，表明肺组织中多余的水分会干扰HYP含量的测定结果，因此应将小鼠肺组织烘干至恒重后再进行水解。优化后的实验方案在BLM诱导小鼠PF的研究中得到了很好的应用，改进后方案测定HYP水平明显高于原方案测定结果，表明改进后的方案能更有效地验证BLM诱导PF的作用。