氯胺B溶液在鸡球虫病疫苗培养及保存中的应用

董 青 ， 宋予震 ， 李建华

(1. 吉林大学动物医学学院 ， 吉林长春130062 ； 2. 河南牧业经济学院 ， 河南郑州450011)

鸡球虫病(Coccidiosis)是鸡常见且危害十分严重的寄生虫病，是由一种或多种球虫引起的急性流行性寄生虫病。该病主要危害10～30日龄的雏鸡或35～60日龄的青年鸡，发病率高达50%～70%，致死率高达80%[1]。当前对球虫病的控制主要还是依靠抗球虫药，但由于抗球虫药物的广泛使用甚至滥用，鸡球虫耐药性的产生已成为无法避免的问题。因此，疫苗免疫开始成为对鸡球虫病进行防治的一个重要趋势[2-4]。目前，生产上常用的鸡球虫疫苗为球虫卵囊弱毒活疫苗[4-6]。但由于鸡球虫特有的发育繁殖方式，即鸡卵囊必须经过孢子化过程才具有感染性，因此，卵囊的培养及保存将直接关系疫苗的成本及免疫的成败。目前在实验室中可以使用的卵囊培养液通常为2.5%的重铬酸钾溶液[7]。但重铬酸钾是一种重金属化合物，长期使用会残留于动物机体和环境中，影响人类和动物健康。随着人们生活的不断提高，绿色畜牧业得到了快速发展，全社会对肉食食品安全问题和环境保护问题越来越重视。因此，寻找一种稳定性好，无污染，具有广谱杀菌能力的溶液作为鸡球虫卵囊培养液和保存液是必需的。本试验旨在探讨氯胺B(苯磺酰氯胺钠盐)溶液对鸡球虫病四价活疫苗(柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫)的培养和保存条件，并通过对其孢子化率和免疫保护效果进行检测，探索保存鸡球虫活疫苗的有效、安全、无毒副作用的方法。

1 材料与方法

1.1 生产用种毒虫株的来源 柔嫩艾美耳球虫早熟减毒株(ETZZ株)，分离自河南省郑州市市郊某鸡场；毒害艾美耳球虫早熟减毒株(ENLY株)，分离自河南省洛阳市某鸡场；堆型艾美耳球虫自然弱毒株(EAXY株)，分离自河南省信阳市某鸡场；巨型艾美耳球虫自然弱毒株(EMZZ株)，分离自河南省郑州市市郊某鸡场。这4种种毒虫株在河南牧业经济学院进行早熟选育，纯化后保存。

1.2 实验动物 SPF鸡，由新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心提供。刚出壳后的1日龄SPF鸡放入专用鸡盒运回实验室，在进行严格消毒的无球虫的育雏室内饲养至2～4周龄；禽舍的最初温度控制在30～35 ℃，每周递减2 ℃，直至室温，湿度控制在55%～65%；24 h光照；饲喂经高压灭菌、无任何药物添加的SPF鸡全价育雏颗粒饲料；饮水引自天然泉水，采用纯净水设备经过三重反渗透净化处理，且加入紫外线和臭氧消毒，确保饮水无球虫。

1.3 鸡球虫病四价活疫苗 疫苗由河南牧业经济学院研制。利用成熟早熟选育技术，在河南省鸡球虫病流行疫区分离的具有良好免疫原性的柔嫩艾美耳球虫(Emeriatanella,E.tenella)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)及毒害艾美耳球虫(E.necatrix)作为鸡球虫病活卵囊疫苗的候选虫株，研制了鸡球虫病四价活疫苗(柔嫩艾美耳球虫ETZZ株+毒害艾美耳球虫ENLY株+堆型艾美耳球虫EAXY株+巨型艾美耳球虫EMZZ株)。

1.4 疫苗检验用虫株 柔嫩艾美耳球虫早熟减毒株(ETAY株)，分离自河南省安阳市某鸡场；毒害艾美耳球虫早熟减毒株(ENSQ株)，分离自河南省商丘市某鸡场；堆型艾美耳球虫自然弱毒株(EALZ株)，分离自河南省林州市某鸡场；巨型艾美耳球虫自然弱毒株(EMPY株)，分离自河南省濮阳市某鸡场。这4种疫苗检验用虫株在河南牧业经济学院进行早熟选育，纯化后保存。

1.5 主要试剂 氯胺B，购自百灵威科技有限公司；重铬酸钾，购自郑州科邦生物科技有限公司；甘油，购自天津化学试剂科技有限公司；食盐，购自兰州市盐业公司；次氯酸钠，购自郑州市德众化学试剂公司。

1.6 鸡球虫新鲜卵囊的制备 取生产用4种艾美耳球虫虫种溶液，孢子化卵囊计数，稀释成5.0×104个孢子化卵囊/mL。经口感染10只2～4周龄SPF鸡，每只接种1 mL(每只鸡的感染量为5.0×104个孢子化卵囊)，分别应于感染后118、121、121 h和130 h检出卵囊。分别收集感染后118～216 h、121～216 h、121～204 h、 130～204 h的粪便并分离卵囊，饱和盐水漂浮法纯化卵囊，然后用20%次氯酸钠溶液处理卵囊，离心洗涤(3 000 r/min，10 min)，收集卵囊。

1.7 鸡球虫卵囊在氯胺B溶液中的孢子化 配制2.5%的重铬酸钾溶液及5种浓度的氯胺B溶液：0.6%、1.2%、2.4%、4.8%、10%；分别将新鲜收集的4种鸡球虫卵囊各分成7组，用100 mL不同浓度氯胺B溶液、高纯水和2.5%重铬酸钾重悬，每组1.0×106个卵囊/mL，置于28 ℃水浴摇床震荡培养。分别于培养后15、20、25、30、40 h和60 h，血球计数板计数法记录孢子化卵囊的数量，计算孢子化率。

1.8 无菌检验 卵囊孢子化结束后，每组孢子化卵囊按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验。

1.9 鸡球虫病四价活疫苗在氯胺B溶液中保存时间的研究

1.9.1 性状检验和卵囊计数 分别将氯胺B溶液中保存的鸡球虫病四价活疫苗于2～8 ℃放置0、3、8、11个月和13个月，观察各保存期的疫苗性状是否发生变化；通过对各保存期疫苗中孢子化卵囊计数，评价保存时间对疫苗卵囊数量的影响。

1.9.2 效力检验 设计5次试验，每次试验分为9组，分别为4个免疫组、1个空白组和4个攻虫对照组，每组10只SPF鸡，分置隔离器内饲养(添加薄膜)。5个批次免疫组试验鸡于3日龄分别经口接种5个保存期(于2～8 ℃放置0、3、8、11个月和13个月) 的鸡球虫病四价活疫苗1羽份，接种后21 d进行攻虫试验，相同批次4个免疫组及相应的4个攻虫对照组试验鸡分别灌服5.0×104个柔嫩艾美耳球虫安阳株(ETAY株)孢子化卵囊、5.0×104个毒害艾美耳球虫商丘株(ENSQ株)孢子化卵囊、15.0×104个 堆型艾美耳球虫林州株(EALZ株)孢子化卵囊、10.0×104个巨型艾美耳球虫自然弱毒株(EMPY株)孢子化卵囊，观察5～7 d，统计各组存活率，并剖检所有试验鸡，检查肠道部位(柔嫩艾美耳球虫检查盲肠；巨型及毒害艾美耳球虫检查小肠中段；堆型艾美耳球虫检查十二指肠)的病变并记分。

1.10 氯胺B溶液的安全性试验 配制1.2%氯胺B溶液。取3～5日龄SPF鸡20只，随机分为2组，试验组10只鸡，每只经口灌服10倍使用剂量1.2%氯胺B溶液(100 μL)；另10只鸡作为空白对照组，分置隔离器中饲养，观察灌服后7～14 d内鸡体健康状况，统计存活率及相对增重率。

2 结果

2.1 鸡球虫新鲜卵囊的制备 通过鸡体传代获得ETZZ株新鲜卵囊4.4×107个/只、ENLY株2.1×107个/只、EAXY株7.6×107个/只和EMZZ株3.1×107个/只。

2.2 鸡球虫卵囊在不同培养液中的孢子化 4种球虫卵囊在1.2%的氯胺B溶液中孢子化25～40 h均可达到90%以上的孢子化率，其中EAXY株在25 h 即可达到90%以上的孢子化率，而EMZZ株在40 h才可达到90%以上的孢子化率，ENLY株和ETZZ株卵囊则在30 h即可达到90%以上的孢子化率，见表1。

表1 4种卵囊在不同培养液中的孢子化率Table 1 Spore rate in different mediums of E. tenella strains

2.3 无菌检验 除高纯水组平板长满细菌外，重铬酸钾和氯胺B组平板均未生长细菌。

2.4 鸡球虫病四价活疫苗在氯胺B溶液中保存时间的研究

2.4.1 性状检测和卵囊计数 重悬于氯胺B溶液中的鸡球虫病四价活疫苗分别于2～8 ℃放置0、3、8、11个月和13个月后，性状均无明显变化，仍为无色透明液体，瓶底有少许沉淀；卵囊数量无明显变化，每羽份疫苗的卵囊数仍保持为(1 700±170)个。见表2。

表2 不同保存时间鸡球虫病四价活疫苗的卵囊计数结果Table 2 Oocysts of tetravalent live vaccine agaist coccidiosism in different storage times

2.4.2 效力检验 免疫新鲜鸡球虫病四价活疫苗于2～8 ℃保存11个月后仍可以保护4个攻虫虫株的感染，试验鸡剖检后十二指肠、小肠及盲肠的病变记分均≤1分，而攻虫对照组各试验鸡相应肠道的病变记分均≥3分，空白组各试验鸡均健康存活。见表3。

表3 鸡球虫病四价活疫苗(于2～8 ℃保存11个月)的免疫效力检验结果Table 3 Immunization efficiency of tetravalent live vaccine agaist coccidiosis in preservation of 11 months at 2～8 ℃

但四价活疫苗于2～8 ℃保存13个月后对4个攻虫虫株的感染保护力降低，试验鸡剖检后十二指肠、小肠及盲肠的病变记分均≥1分，而攻虫对照组各试验鸡相应肠道的病变记分均≥3分，空白组各试验鸡均健康存活。

2.4.3 安全性试验 给予10倍使用剂量1.2%氯胺B溶液后14 d内，所有试验鸡均健康存活，试验组和空白对照组存活率均为100%；试验组与空白对照组各试验鸡相对增重率均无明显差异，试验组和空白对照组相对增重率分别为99.8%和100%。

3 讨论

2.5%的重铬酸钾溶液常作为鸡球虫卵囊培养液和保存液。它可以杀灭卵囊所携带的及环境中的微生物，减少竞争性氧消耗，有利于鸡球虫卵囊的保存[7]。但是重铬酸钾是一种重金属化合物，长期使用会残留于动物机体和环境中，影响人类和动物健康。近年来,我国不少学者在鸡球虫卵囊培养和保存的开发和应用方面也取得了一些成绩。

龚振兴等采用山梨酸钾水溶液作为鸡球虫卵囊培养和保存液，试验证实，1%～3%山梨酸钾水溶液对卵囊孢子化不产生影响，且具有明显的抑菌作用，能显著提高在4 ℃下长时间保存的鸡球虫卵囊活力，如应用到鸡球虫病活疫苗，将显著提高疫苗保存期，降低生产成本[8]。

谭志坚等采用氯胺T(对甲苯磺酰氯胺钠)与纯净水以(0.5～8.0)∶100的比例经充分摇匀制备而构成的氯胺T溶液作为鸡球虫卵囊培养和保存液，经过该培养液和保存液处理的球虫卵囊，其孢子化率高达80%以上，无菌检验结果为阴性，鸡球虫卵囊在4～8 ℃保存9个月未受影响，效果明显优于传统的2.5%重铬酸钾溶液[9]。

与氯胺T相似，氯胺B为白色或微黄的晶体或粉末，也是一种有机氯消毒剂，含有效氯26%～28%，易溶于水、稳定性好，无污染，是一种具有广谱杀菌能力的消毒剂。主要用于饮用水食具、水果蔬菜消毒、养殖水质和搪瓷器具消毒。还可用于乳牛乳房及挤奶杯的清洗及家畜泌尿道和化脓创的冲洗消毒等。

本试验发现，1.2%的氯胺B溶液中可使鸡球虫卵囊孢子化率提高至90%以上，同时抑制细菌的生长，对鸡体无毒副作用。同时疫苗在2～8 ℃保存至11个月活力仍不受影响，表现出良好的免疫保护效果。

综上所述，1.2%的氯胺B溶液可以取代重铬酸钾作为鸡球虫活疫苗的培养和保存液。氯胺B溶液的发现克服了已有技术的一些缺点，实现了目前球虫活疫苗技术生产工艺上的突破和创新，避免了重金属物质(重铬酸钾)或防腐剂(甲醛)在鸡体内的残留和环境污染。