中华蜜蜂磷酸丙糖异构酶基因克隆及生物信息学分析

樊兆斌 , 张淑萍 , 葛中东 , 周宛蓉 , 张 凯 , 夏宇欣 , 姜莉莉 , 蒋培红

(1. 菏泽学院药学院 ， 山东 菏泽 274015 ； 2. 菏泽市食品药品检验检测研究院 ， 山东 菏泽 274000)

(磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase，Tpi)作为一种代谢酶,参与机体细胞质内的葡萄糖分解代谢，可催化磷酸二羟丙酮(DHAP)与3-磷酸甘油醛(GAP)之间的转化[1],在糖酵解、脂肪酸合成等途径中发挥着重要作用[2-3]。目前已从人、兔、鼠、绵羊、牛、果蝇、蚊、黄粉虫等多种生物中克隆了该酶的基因。高等动物体内Tpi的变异或缺乏会引起身体多种系统疾病，甚至导致死亡[4-5]。蜜蜂作为重要的农业经济昆虫，在地球生态系统中占据重要地位，并发挥重要作用。本文旨在对中华蜜蜂幼虫Tpi基因进行克隆、测序及序列分析，并利用生物信息学软件对该基因编码蛋白进行生物学信息学分析，以期为Tpi的功能研究提供有价值的参考资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 动物组织总RNA提取试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、D 2 000 Marker、质粒小提试剂盒、pGM-T载体、T4 DNA 连接酶等，均购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶BamH I与XhoⅠ，购自Thermo Fisher公司。

1.2 主要仪器 PCR仪(ABI美国)，离心机(湖南湘仪公司)。

1.3 试验动物 5～7日龄中华蜜蜂幼虫由本实验中心提供。

1.4 试验方法

1.4.1 引物设计 根据GenBank中已发表的意蜂Tpi基因序列(XM_017060592.2)设计中华蜜蜂Tpi(AcTpi)基因扩增引物F/R，F:5′-ATCGGATCCGCCATGGGTCGTAAATT-3′(BamH I位点)，R:5′-AGTCTCGAGTCACTGCTTAGCGTTAAC-3′(XhoⅠ位点)，引物由华大基因有限公司合成。

1.4.2AcTpi基因PCR扩增 按照试剂盒说明书进行蜜蜂幼虫总RNA提取和cDNA合成。以提取的cDNA为模板，用引物F/R进行目的基因扩增。PCR反应体系50 μL:2×TaqPCR Master Mix 25 μL,cDNA 模板 1 μL，上下游引物(10 pmol/L)各 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环；72 ℃延伸 7 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.3 PCR产物连接、转化及测序 经胶回收试剂盒回收PCR产物，16 ℃条件下过夜连接pGM-T载体，产物转化大肠杆菌(DH5α)感受态细胞，涂布LB(A+)平板，37 ℃过夜培养，挑取单个圆滑白色菌落摇菌并提取质粒。经PCR筛选阳性重组质粒，选取3个阳性克隆送华大基因有限公司测序。

1.4.4 序列分析 使用DNASTAR软件将扩增的AcTpi基因序列与GenBank上已发表的中华蜜蜂(KP994676.1)、意大利蜜蜂(EU760983.1)、大蜜蜂(XM_006622725.2)、小蜜蜂(XM_003691109.2)、欧洲熊蜂(XM_012314761.2)、东方熊蜂(XM_012389323.2)、红斑石蜂(XM_029195143.1)、苜蓿切叶蜂(XM_003700486.2)、东南蓝莓蜜蜂(XM_017942917.1)、集蜂(XM_015574859.1)、麦茎蜂(XM_015745758.2)以及短管赤眼蜂(XM_014372053.2)的Tpi基因序列进行同源性比对，由MEGA 5软件绘制Neighbor Joining系统进化树；在NCBI中进行Tpi基因序列开放阅读框的识别并翻译成氨基酸序列。

1.4.5 生物信息学分析 利用 Protparam在线程序预测AcTpi编码氨基酸的基本理化性质；利用NCBI的 Conserved Domain Database对AcTpi编码蛋白进行氨基酸保守结构域的预测。利用Protscale、TMHMM 2.0 等在线软件分析AcTpi编码氨基酸序列的疏水性、跨膜结构。采用SignalP-5.0 Server预测蛋白信号肽，利用NetPhos 3.1 Server，NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0进行潜在磷酸化位点及潜在O、N糖基化位点预测。利用网站http://Imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl进行抗原决定簇预测。利用ABC pred在线软件对AcTpi进行B细胞表位预测，利用SOP-MA和Swiss-Model预测AcTpi的二级和三级结构。

2 结果

2.1AcTpi基因PCR扩增结果 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为750 bp的特异性条带(图1)，与预期的片段大小相符。

图1 AcTpi基因PCR扩增Fig.1 Amplification of AcTpi gene by PCRM：D 2 000 DNA相对分子质量标准； 1:AcTpi PCR产物M:D 2 000 DNA marker； 1:PCR product of AcTpi

2.2AcTpi基因同源性比对及系统进化树构建 应用DNAMAN 软件分析测序结果显示，AcTpi基因的CDS区全长744 bp，共编码247个氨基酸，碱基组成分别为A(36.96%)、T(29.44%)、C(11.96%)、G(21.64%)，(G+C)%为33.60%。将AcTpi基因序列与GenBank中参考物种进行同源性比对，结果见图2。结果表明，AcTpi基因与已发表的中华蜜蜂、意大利蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、东方熊蜂、红斑石蜂、苜蓿切叶蜂、东南蓝莓蜜蜂、集蜂、麦茎蜂以及短管赤眼蜂的Tpi基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.9%、98.3%、96.9%、88.8%、88.6%、88.4%、88%、87.9%、85.1%、78.9%和77.6%。

图2 中华蜜蜂与其他物种Tpi基因同源性比对Fig.2 Homology comparison of Tpi gene between Apis cerana cerana and other species注(Note)：Ac：中华蜜蜂(Apis cerana)； Am:西方蜜蜂(Apis mellifera)；Ad:大蜜蜂(Apis dorsata)； Af:小蜜蜂(Apis florea)； Bt:欧洲熊蜂(Bombus terrestris)； Bi:东方熊蜂(Bombus impatiens); Ob:石蜂(Osmia bicornis); Mr:苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)； Hl:东南蓝莓蜜蜂(Habropoda laboriosa)；Dn:集蜂(Dufourea novaeangliae); Cc:麦茎蜂(Cephus cinctus)； Tp:短管赤眼蜂(Trichogramma);下同(The same as below)

利用MEGA 5软件对中华蜜蜂与GenBank中参考物种Tpi基因序列绘制Neighbor Joining系统进化树，结果见图3。由图3可见，Tpi基因进化树总体分为两大支，中华蜜蜂最先与意大利蜜蜂聚在一起，与大蜜蜂和小蜜蜂聚为一小支，然后再与东南蓝莓蜜蜂、东方熊蜂和欧洲熊蜂聚在一起，之后再与集蜂、苜蓿切叶蜂和野蜂聚为一大支。麦茎蜂和短管赤眼蜂聚为一支。

图3 中华蜜蜂与其他物种基于Tpi编码氨基酸序列的分子进化树Fig.3 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of Tpi from Apis cerana cerana and other species

2.3AcTpi编码氨基酸理化特性及结构域分析 运用ExPASy 的ProtParam数据库对AcTpi编码蛋白的理化性质预测，推测AcTpi编码蛋白分子式是C1206H1918N328O359S4， 理论分子量为26.88 kDa，理论等电点为7.76，脂肪指数为93.52，主要由22 种氨基酸编码，该蛋白不稳定系数为27.32(<40)，提示该蛋白较稳定。对AcTpi编码蛋白的氨基酸保守结构域进行预测分析，结果如封二彩版图4所示，AcTpi属于T细胞免疫球蛋白域黏蛋白(T cell immunoglobulin domain mucin，Tim)超级家族，含有1个保守结构域。

2.4AcTpi编码蛋白亲水性/疏水性、跨膜螺旋结构及修饰结构预测 利用ExPASy ProtScal程序，对AcTpi基因编码产物的亲/疏水性分析，AcTpi疏水性图谱如图5所示，图中纵坐标0值以上为疏水区，其分值越高，疏水性越强；0值以下为亲水区。整个多肽链有2个明显的亲水区，多肽链的第135位Ala(A)和第136位Gly(G)分值最低(-2.411)，亲水性最强。第42位的Val(V)分值最高(1.911)，疏水性最强；该氨基酸序列内超过半数为亲水性残基，整条多肽链表现为亲水性，平均亲水指数为-0.182。

图5 AcTpi编码蛋白亲/疏水性预测Fig.5 The hydrophily/hydrophobicity profile of AcTpi coiding protein

利用在线跨膜区结构预测软件TMHMM 2.0进行AcTpi编码蛋白序列跨膜区分析，结果表明，该蛋白不含跨膜区，均为胞外区。对AcTpi基因信号肽进行预测结果表明，该蛋白没有信号肽区域，不是分泌型蛋白。利用NetPhos3.1 Server 进行潜在磷酸化位点预测，结果显示，阈值0.5 时，AcTpi存在17个潜在的磷酸化位点，其中包括8个苏氨酸(Thr) (位于肽链的第16、48、65、146、171、176、198位和第202位)和9个丝氨酸(Ser)(位于肽链的第18、44、78、95、118、155、192、210位和第234位)。利用软件NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0进行潜在O、N糖基化位点预测，结果显示，AcTpi不存在O-糖基化位点；AcTpi存在3个潜在的N-糖基化修饰位点，分别位于第14、57、196位氨基酸残基，概率分别为0.788 4、0.591 8和0.656 7。

2.5AcTpi编码蛋白抗原决定簇及B细胞表位预测 抗原决定簇预测结果表明，该蛋白的平均抗原倾向指数为1.020 3，如封二彩版图6所示，共含有10个抗原决定簇区域，分别位于20～29，32～52，64～70， 86～93，108～127，138～146，156～168，179～185，199～209位及225～243位氨基酸残基。结果表明，AcTpi编码蛋白含有较多的优势抗原表位结构，抗原倾向指数高。

通过在线预测软件ABC pred得到可能形成B细胞线性表位的氨基酸序列区域为182～192、25～35、222～232、202～212、124～134、208～218、166～176、40～50、230～240、132～142、88～98、142～152、74～84、16～26和8～18；使用 IEBD对AcTpi的B细胞表位进行预测，预测的区域为11～20、130～139和210～224。综合两者的预测区域，两者重叠区域可能形成B细胞线性表位的氨基酸序列为20～25、 130～139和210～218。

2.6AcTpi蛋白高级结构预测 使用在线预测软件SOP-MA预测AcTpi的二级结构，结果表明，该蛋白二级结构中α-螺旋占45.34%，β-折叠占17.41%，β转角占5.67%，无规则卷曲占31.58%。利用SwissModel数据库预测该蛋白的三维结构，如封二彩版图7。

3 讨论

磷酸丙糖异构酶(Tpi)能够催化磷酸二羟丙酮和D型3-磷酸甘油醛，用于磷酸丙糖异构体之间的可逆转换，在糖酵解和脂肪酸合成等途径中具有非常重要的作用。目前尚未找到替代Tpi酶学活性的酶类,针对Tpi的研究主要集中在物理性质、催化机理、催化过程中能量转换、临床药物或疫苗研发等方面。Tpi作为弓形虫的外分泌蛋白可引起宿主产生强烈的免疫应答[6],具有作为弓形虫感染标志物开发诊断试剂的潜在价值[7]。Tpi是世界卫生组织(WHO)推荐的最具潜力的血吸虫疫苗候选分子之一[8]。Tpi能够触发天然供体对1型细胞因子的免疫应答[9]。此外，Niaz课题组研究表明，Tpi是miR-22和miR-28的新靶点，miR-22/28介导的Tpi的转录后调控可能增加肿瘤细胞糖酵解能力，从而在肿瘤发生中产生重要意义[10]。

同源性比对结果显示，中华蜜蜂与意大利蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂Tpi编码蛋白的同源性较高，序列同源性高达99.6%、98.4%和97.6%。蛋白质结构域预测为蛋白质组学研究提供重要的信息，同时为深入了解蛋白质功能提供重要依据。本试验克隆得到中华蜜蜂Tpi基因序列，并对其蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、保守区结构域以及二级结构进行了预测分析，对深入了解中华蜜蜂Tpi基因及其功能研究具有重要意义。跨膜区预测结果显示，AcTpi氨基酸序列无跨膜区，且氨基酸残基均位于胞外，是一种外膜蛋白。该蛋白不含信号肽，不含跨膜区，极有可能在细胞内参加机体反应。抗原表位又称为抗原决定簇，是抗原分子表面具有特殊结构和免疫活性的化学基团，可刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。在线软件ABC pred预测Tpi编码蛋白的B细胞表位，保留得分>0.8的结果，可提高预测准确性。抗原决定簇预测结果显示，AcTpi编码蛋白氨基酸序列含有10个潜在的抗原决定簇区域，抗原倾向指数高，提示该蛋白具有良好的免疫原性，易被免疫系统识别并产生有效的免疫反应。二级结构预测显示，AcTpi编码蛋白主要以无规则卷曲为主，存在多个α螺旋和β折叠区域。结果为进一步阐明中华蜜蜂Tpi在糖酵解过程中的作用及其功能的开发应用提供了科学依据。