猪瘟病毒化学发光竞争ELISA抗体检测试剂盒的应用研究

徐 璐 ， 张乾义 ， 夏应菊 ， 任雪健 ， 李 翠 ， 邹兴启 ， 徐 嫄 ， 王 兆 ， 赵启祖 ， 王 琴

(1.中国兽医药品监察所 国家/OIE猪瘟参考实验室 ， 北京 海淀 100081 ； 2. 洛阳莱普生信息科技有限公司 ， 河南 洛阳 471000)

猪瘟在我国为优先防治的重大动物疫病之一。虽然在2017年3月，该病已经正式退出国家的强制免疫计划[1]，但猪瘟疫苗仍然是我国免疫覆盖率最高的猪用疫苗之一。近年来，市场上不断有猪瘟抗体检测试剂盒面世，但仍以传统的间接或阻断ELISA方法为主[2]，试剂盒的操作便捷性和信号灵敏度等方面并未有明显的提高。对于各大中型养猪场及各级动物疫病控制中心来说，猪瘟抗体检测的样本量大，操作复杂，存在检测时间长，劳动强度大等问题。另外，传统ELISA试剂盒多采用TMB底物，信号的线性范围窄，无法准确区分不同抗体效价的血清，大大影响了试剂盒的检测效果。

本课题组采用猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体作为竞争抗体，以化学发光底物作为显色体系，开发了猪瘟病毒化学发光竞争ELISA抗体检测试剂盒(简称：发光试剂盒)。为了评价该试剂盒的临床应用效果，采用本试剂盒和进口试剂盒同时在6个地区进行了临床试验，共检验血清样本2 200份。为了进一步验证试剂盒检测结果的准确性，对田间采集的391份血清样本采用猪瘟抗体检验金标准方法-荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent antibody virus neutralisation test，FAVN)进行了定性检测，评价本试剂盒与FAVN的符合率。另外，采用本试剂盒对5头免疫猪的抗体消长规律进行了监测，进一步评价本试剂盒对免疫血清的检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料 PK15传代细胞系、猪瘟病毒Thiverval 株由中国兽医药品监察所鉴定、保存并提供；猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体，由中国兽医药品监察所制备并提供；FITC羊抗鼠二抗，购自Sigma公司；发光试剂盒，批号为E160602，由洛阳莱普生信息科技有限公司制备；猪瘟病毒抗体检测试剂盒(简称：进口试剂盒)，批号为G261，购自IDEXX公司。

1.2 试验动物 3月龄健康仔猪，未免疫猪瘟疫苗，无猪瘟母源抗体，购自保定山区散养户。

1.3 血清样本 临床血清样本2 200份，分别由6家地市级动物疫病预防控制中心提供，采自山东、河南、山西省和陕西省；田间采集的猪瘟疫苗免疫和非免疫血清，共计391份。

1.4 试验方法

1.4.1 临床血清样本的检测 将6家实验单位提供的2 200份临床血清样本，分别用发光试剂盒和进口试剂盒进行检测，检测步骤按照试剂盒说明书进行，计算2种试剂盒的一致性。

1.4.2 与金标准方法的比较 将田间采集的391份血清，分别采用发光试剂盒和FAVN方法对血清样本进行检测，计算发光试剂盒与FAVN之间的一致性。FAVN试验具体操作步骤参见《陆生动物诊断试剂和疫苗手册》[3]。

1.4.3 统计学方法 选择SPSS统计学软件计算Kappa值，进行一致性分析，对应Kappa 值为：0.0～0.20极低的一致性、0.21～0.40一般的一致性、0.41～0.60 中等的一致性、0.61～0.80 高度的一致性和0.81～1几乎完全一致。

1.4.4 对免疫抗体消长的检测 将试验猪分为2组。第1组5头猪，为免疫组，每头猪免疫1头份猪瘟活疫苗(传代细胞源)，批号为0907，广东永顺生物制药有限公司产品；第2组2头猪，为对照组，每头猪接种1 mL生理盐水。分别于免疫之后的第1、3、6、9、12、15、18、21、28、32、39、50、56、63、70、80、112天和第177天采集血清，用发光试剂盒进行检测，观察免疫抗体消长趋势。

2 结果

2.1 对临床血清样本的检测 在临床检测的2 200份猪血清样本中，发光试剂盒检测出1 452份阳性，748份阴性；进口试剂盒检测出1 420份阳性，769份阴性，结果见表1。采用SPSS软件，计算2种试剂盒的Kappa值为0.78，说明发光试剂盒与进口商品化试剂盒具有高度一致性。

表1 发光试剂盒与进口试剂盒的一致性Table 1 The coincidence of CLIA kit with IDEXX kit

2.2 与金标准方法的比较 在391份血清中，包括猪瘟抗体阳性血清191份，阴性血清200份。其中发光试剂盒检测出191份阳性，其中182份与FAVN结果一致；检测出200份阴性，有191份与FAVN结果一致，结果见表2。采用SPSS软件，计算2种方法的Kappa值为0.908，二者结果几乎完全一致，说明该试剂盒的检测结果更接近于金标准方法。

表2 发光试剂盒与FAVN的一致性Table 2 The coincidence of CLIA kit with FAVN

2.3 免疫血清抗体消长规律 从检测结果可以看出，免疫后15 d，4/5的免疫猪抗体转阳，免疫后18 d， 全部免疫猪的抗体转阳。而未免疫对照组直至试验结束均为抗体阴性。从中插彩版图1中可以看出，免疫后177 d，5头免疫猪的猪瘟抗体仍为阳性，且不同个体的抗体水平存在较大差异。

3 讨论

ELISA方法检测到的抗体均为结合抗体，虽然这些抗体能够与抗原发生特异性结合，但不一定会使病原失去感染性。而中和抗体则不同，与病原结合后，能够使病原丧失感染宿主细胞的能力。有研究表明[4]，疫苗免疫后的阳性血清对不同猪瘟毒株的中和抗体效价不同。在猪瘟疫苗免疫初期，细胞免疫对攻毒保护起了非常重要的作用。而在免疫的中后期，体液免疫在疫苗保护中起了决定作用。因此中和抗体能够更加准确的反应机体的免疫状况，更适用于免疫效果评价。有研究者对结合抗体和中和抗体效价进行了比较，证明二者的相关性根据方法不同而有所差异[5-6]。

猪瘟疫苗免疫后，能够引起体液免疫反应，使机体产生特异性的抗体。猪瘟抗体检测包括2类，一类为检测结合抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)、正相间接血凝试验(IHA)、抗体胶体金免疫快速检测技术[7]、琼脂扩散试验以及免疫芯片技术等；另一类为检测中和抗体的病毒中和试验。病毒中和试验是检测猪瘟抗体的金标准方法，但该方法的操作复杂，检测时间长，检测成本高，影响因素多，无法推广使用。发光试剂盒通过对单克隆抗体的筛选，选择了1株具有适宜亲和力、且具有中和活性的单克隆抗体作为本试剂盒的竞争抗体，减少了检测步骤，大大缩短检测时间至1 h以内。通过对2 200份临床血清的检测，证明发光试剂盒与进口商品化试剂盒的检测结果具有高度的一致性，说明本试剂盒的敏感性、特异性等关键指标均不低于进口产品。而与金标准方法(FAVN)的比较结果说明本试剂盒的结果与中和抗体效价更为接近。

采用发光试剂盒对免疫后猪血清抗体的消长情况进行检测，证明在免疫后18 d，所有的免疫血清全部转为阳性。而在本课题组之前的研究中，免疫猪血清在免疫后15～28 d可全部转为阳性，与本研究的结果基本一致[8-9]，说明本试剂盒的灵敏度不低于现有商品化ELISA试剂盒产品。另外，从结果中可以看出，不同的个体免疫后抗体增长的时间和增长幅度有很大差异，说明个体差异对免疫效果存在很大影响。