响应面法优化圣女果百香果复合发酵饮料工艺及品质分析

李昌宝，辛 明，孙 宇，唐雅园，李杰民，盛金凤，李 丽，李志春，孙 健*

（1.广西壮族自治区农业科学院 农产品加工研究所，广西 南宁 530007；2.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西 南宁 530007）

圣女果（Lycopersicon esculentumMill.）又称迷你番茄、小番茄等，属茄科番茄属植物，主要作为水果食用，被联合国粮农组织列为优先推广的“四大水果”之一[1-3]。圣女果富含维生素、矿物质、有机酸等营养成分，特别是成熟果实中所含的番茄红素，是一种天然的超级抗氧化剂[4-5]。圣女果具有美容养颜、促进体内血液循环、增强抵抗力等功效[6-7]。百香果（Passiflora edulisSims）为西番莲科西番莲属多年生藤本植物[8-9]，是热带亚热带地区特有的水果。百香果果实成熟后香味丰富，其果浆可散发出10多种水果浓郁芬芳的香气，享有“饮料之王”的美誉[10]。百香果果实多汁，风味独特，具有很高的营养价值，富含人体必需的17种氨基酸、多种维生素及钠、钾、钙、镁、锌、铁等对人体有益的矿物元素[11-12]。百香果还是一种传统的药用果实，具有丰富的医药保健功能，如活血强身、滋阴补肾、生津止渴、抗焦虑、抗炎等[12-14]。

圣女果和百香果都属于呼吸跃变型水果，在采后不易贮存，特别在炎热的夏季更易腐烂、发酵产生异味等腐败变质现象，降低果实的商品价值。因此，深加工是解决圣女果和百香果采后不耐贮存的重要手段之一。乳酸菌发酵可以改善果蔬汁的风味，提高果蔬汁的营养价值，防止果蔬汁变坏，延长保存期，增加保健作用[15]。植物性乳酸菌发酵饮料正成为新的开发热点，如番茄苹果复合乳酸菌发酵饮料[16]、番茄胡萝卜发酵乳酸饮料[17]、百香果汁发酵乳饮料[18]等。本研究以圣女果、百香果为原料，研究利用发酵乳杆菌发酵圣女果百香果饮料的加工工艺，考察乳酸菌菌种添加量、发酵时间、发酵温度、果汁配比等发酵条件对圣女果百香果发酵饮料的影响，通过响应面试验对发酵条件进行优化，同时分析了其品质指标，以期为圣女果和百香果深加工产业开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

圣女果：由广西壮乡河谷农业科技有限公司提供；百香果：由浦北南国水果种植农民专业合作社提供；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）：广西农业科学院农产品加工研究所；白砂糖：市售；MRS培养基（食品级）：德州润昕实验仪器有限公司；2,6-二氯靛酚、福林酚、蒽酮（分析纯）：厦门海标科技有限公司；草酸、盐酸、氢氧化钠、亚硝酸钠、碳酸钠（均为分析纯）：沧州临港滨海化工有限公司；葡萄糖（分析纯）：佛山市柏士食品有限公司；石油醚：常州市中超化工有限公司；蒽酮：上海通蔚生物有限公司；没食子酸、番茄红素（均为标准品）：中国计量科学院；硫酸亚铁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

PGL精密天平：深圳市怡华新电子有限公司；UV-6100紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；PHS-2C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；捷呈LRH生化培养箱：上海捷呈试验仪器有限公司；LD8X-75KBS高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；A3000榨汁机：南京汉越电子科技有限公司；GYB60-6S高压均质机：上海东华高压均质机厂；IGMA3K15高速冷冻离心机：曦瑪离心机（扬州）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

（1）圣女果汁制备：选择成熟度高、颜色艳丽、无腐烂、无病虫的新鲜圣女果，用清水洗干净后沥干水分，用榨汁机打浆，过100目滤布，取滤液备用。

（2）百香果汁制备：选择9成熟、无腐烂、无病虫的新鲜百香果，去皮，去籽，过100目滤布，取滤液备用。

（3）调配、均质：按比例加入圣女果汁和百香果汁，添加总体积8%的白砂糖，采用高压均质机在15 MPa条件下进行均质。

（4）灭菌：将调配好的复合果汁在85℃条件下杀菌15min，冷却至室温，备用。

（5）菌种活化：将发酵乳杆菌的保藏菌种培养物解冻，取100 μL于MRS平板上进行活化复壮后，接种到50 mL的菌液中，并放入37 ℃恒温培养箱培养24 h。

（6）接种发酵：将杀菌后的复合果汁在无菌操作条件下接入经过活化的发酵乳杆菌菌液，在一定温度下恒温按试验设计时间发酵，完成后在4 ℃条件下后熟12 h。

1.3.3 工艺优化单因素试验

通过预实验，确定以菌种添加量、发酵温度、发酵时间、果汁配比（圣女果∶百香果）为主要影响因素，以感官评分为测试指标，确定发酵因素水平。

菌种添加量的确定：固定发酵温度为37 ℃、发酵时间24 h、果汁配比5∶1，考察不同菌种添加量1%、2%、3%、4%、5%（体积分数）对圣女果百香果复合发酵饮料的影响。

发酵温度的确定：固定菌种添加量3%、发酵时间24 h、果汁配比5∶1，考察不同发酵温度27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃对圣女果百香果复合发酵饮料的影响。

发酵时间的确定：固定菌种添加量3%、发酵温度为37 ℃、果汁配比5∶1，考察不同发酵时间18 h、24 h、30 h、36 h、42 h对圣女果百香果复合发酵饮料的影响。

果汁配比的确定：固定菌种添加量3%、发酵温度为37 ℃、发酵时间24 h，考察果汁配比（圣女果∶百香果）1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1对圣女果百香果复合发酵饮料的影响。

1.3.4 响应面优化发酵工艺

在单因素试验的基础上，采用Box-Benhken试验设计，设置菌种添加量（B）、发酵温度（B）、发酵时间（C）和果汁配比（D）4个因素为自变量，以单因素结果为中心点，设3个水平，以发酵产品感官评分（Y）为响应值，进行发酵工艺优化，响应面试验因素与水平见表1。

表1 Box-Benhken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.5 理化指标测定

pH值：采用pH计测定；可溶性固形物：采用手持折光仪测定；总酸（以柠檬酸计）：按照GB/T12456—2008《食品中总酸的测定》中的滴定法测定[19]；还原糖：按照GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》测定[20]中的直接滴定法；总酚：采用福林酚法测定[21]，结果以没食子酸当量表示；总黄酮：参考程诗韔[22]方法测定；番茄红素：参考李丽杰[23]方法测定；维生素C（vitamin C，VC）：采用2,6-二氯靛酚滴定法[24]；乳酸菌菌落总数：按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》测定[25]。

1.3.6 感官评分

选择10人组成感官评价小组，对圣女果百香果复合发酵饮料的色泽、气味、口感、组织形态进行评价，满分100分，感官评分标准见表2。

表2 圣女果百香果复合发酵饮料感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of compound fermented beverage of cherry tomato and passion fruit

1.3.7 数据处理

试验数据采用Design Expert 8.0.6进行分析处理，采用Origin 8.0软件绘图处理。每组试验3次平行，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 圣女果百香果复合发酵饮料工艺优化单因素试验

2.1.1 菌种添加量对圣女果百香果复合发酵饮料品质的影响

图1 菌种添加量对发酵饮料感官评分及总酸含量的影响Fig.1 Effect of inoculum on sensory score and total acid content of the fermented beverage

由图1可知，随着菌种添加量的增加，圣女果百香果复合发酵饮料的感官评分先逐渐增加，当菌种添加量为3.0%时，感官评分达到最高，为81分；之后随着添加量增加，感官评分有所下降，可能是因为菌种添加量过多使发酵过度，酸度过高，影响口感。总酸含量随着菌种添加量的增加呈现先升高后下降的趋势，在添加量为4%的时候，总酸含量最高。这与蔺志颖[26]研究椰浆蛋白发酵饮料的结果一致。这是由于菌种接种量较低时，乳酸菌繁殖基数少，活菌数增加相对较慢；接种量过大，会导致底物消耗过快，产酸过快以及乳酸菌代谢产物的增加都会抑制乳酸菌的活性[27]，只有适宜的接种量才能使乳酸菌的繁殖和产酸能力达到最佳。因此，综合考虑感官评分及总酸含量，本试验确定接种量为2%～4%。

2.1.2 发酵温度对圣女果百香果复合发酵饮料品质的影响

图2 发酵温度对发酵饮料感官评分及总酸含量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score and total acid content of the fermented beverage

由图2可知，随着发酵温度升高，感官评分和总酸含量均呈先升高后降低的趋势，在37 ℃时，感官评分和总酸含量均达到最大值，分别为81分、5.27 g/100 g。这是由于乳酸菌的活性和温度密切相关。发酵温度过低，乳酸菌繁殖缓慢，产酸量低；发酵温度过高，乳酸菌繁殖迅速，代谢旺盛，甚至使乳酸菌死亡而影响产酸量[28]。这与张婉滢[29]研究胡萝卜乳酸饮料的结果一致。因此，综合考虑感官评分及总酸含量，本试验确定发酵温度为32～42 ℃。

2.1.3 发酵时间对圣女果百香果复合发酵饮料品质的影响

图3 发酵时间对发酵饮料感官评分及总酸含量的影响Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score and total acid content of the fermented beverage

乳酸菌发酵产酸量及发酵的完全程度会受发酵时间直接影响。由图3可知，随着发酵时间的延长，感官评分和总酸含量先快速增加后缓慢变化。在发酵时间18～30 h内，菌种不断利用发酵基质中的糖类产酸，使乳酸累积，持续产酸，使得产品酸度呈上升趋势。乳酸菌发酵不仅可以提高产品的酸度，还对产品的风味等产生积极影响，因此感官评分也越来越高。在发酵30 h时，感官评分到达最大值85分。在发酵30 h之后，感官评分出现缓慢下降，总酸含量基本趋于稳定，可能是由于前期乳酸菌利用底物繁殖，产酸率较快，而随着发酵时间的延长，一部分乳酸菌衰老死亡，另外随着产酸量的升高，乳酸菌也会受到不同程度的抑制而使产酸量下降，总酸含量基本不再改变[30]。这与张春岭[30]研究红枣乳酸发酵饮料的结果一致。因此，综合考虑感官评分及总酸含量，本试验确定发酵时间为24～36 h。

2.1.4 果汁配比对圣女果百香果复合发酵饮料品质的影响

图4 圣女果与百香果汁配比对发酵饮料感官评分及总酸含量的影响Fig.4 Effect of cherry tomato and passion fruit juice ratio on sensory score and total acid content of the fermented beverage

由图4可知，果汁配比对发酵饮料的感官评分和总酸含量影响较大。随着复合果汁配比的增加，圣女果百香果复合发酵饮料的感官评分呈现先升高后下降的趋势。当果汁配比为5∶1时，果汁酸甜适中，感官评分最高。逐渐增加圣女果汁的比例，果汁的口感、颜色越好，但圣女果汁比例过高则百香果的香气不足，风味欠佳，感官评价降低。随着复合果汁配比的增加，总酸含量逐渐下降，这是由于百香果的总酸含量较高，当百香果的比例下降时，对应的总酸含量也逐渐下降。因此，综合考虑感官评分及总酸含量，本试验确定果汁配比为3∶1～7∶1（V∶V）。

2.2 响应面试验优化圣女果百香果复合发酵饮料工艺

2.2.1 响应面设计及方差分析

根据单因素试验结果，以菌种添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）和果汁配比（D）为自变量，感官评分（Y）为因变量进行响应面试验，Box-Benhken试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

采用Design Expert 8.0.6软件对表3数据进行二次回归方程拟合，得到感官评分（Y）对菌种添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）和果汁配比（D）的二次多项回归方程：

表3 复合发酵饮料工艺优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface methodology for compound fermented beverage technology optimization

表4 响应面试验方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

续表

从表4可以看出，所获得的回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明模型有效，能够较好的预测试验值。一次项A、C、D对感官评价影响极显著（P＜0.01），B对其影响不显著；交互项AB、AD、BC、CD对感官评价影响极显著，AC、BD对其影响不显著；二次项A2、B2、C2、D2影响极显著（P＜0.01）。由P值结果得出对感官评分影响大小依次为：果汁配比＞发酵时间＞菌种添加量＞发酵温度。

2.2.2 各因素响应面交互作用分析

采用Design Expert8.0.6软件对影响圣女果百香果复合发酵饮料的4个因素进行交互分析，结果见图5。

图5 各因素交互作用对感官评分影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each two factors on the sensory score

利用模型可拟合出两两因素间相互作用的响应面图，可以进一步研究各因素间的交互作用强弱。由图5A、D、E、F可知，随着各因素的增加，感官评分均呈现先增加后下降的趋势，且响应面形状陡峭，说明两者交互作用显著，与方差分析结果一致；由图5B可知，感官得分随着发酵时间的增加呈先上升后下降的趋势，随着菌种量的增加上升缓慢，发酵温度和菌种添加量的交互作用不显著；由图5C可知，感官得分随着圣女果∶百香果汁配比的增加呈先上升后下降的趋势，随着发酵温度的增加上升缓慢，果汁配比和发酵温度的交互作用不显著（P＞0.05）。

2.2.3 最优发酵条件的确定及验证

由Design Expert8.0.6软件得出复合果汁发酵饮料的最佳发酵工艺参数是果汁配比5.69∶1、发酵时间30.98 h、菌种添加量2.94%、发酵温度37.39 ℃，复合果汁发酵饮料的感官评分的预测值为82.46分。为便于实际操作，将发酵工艺条件修改为圣女果百香果果汁配比6∶1、发酵时间31 h、菌种添加量3%、发酵温度37 ℃。根据此条件进行验证试验，得出复合果汁发酵饮料的感官评分实测值为82分。该值与预测值比较近，因此选取此为复合果汁发酵饮料的发酵工艺参数。

2.3 圣女果百香果复合发酵饮料品质分析

利用最优发酵条件发酵的圣女果百香果复合发酵饮料品质指标见表5。

表5 圣女果百香果复合发酵饮料品质指标Table 5 Quality indexes of compound fermented beverage with cherry tomato and passion fruit

续表

由表5可知，复合发酵饮料的pH、可溶性固形物、总酸、还原糖、总酚、总黄酮、番茄红素、维生素C、乳酸菌总数分别为3.30、11.50%、5.95 g/100 mL、6.68 g/100 g、40.03 mg/100 g、6.83 mg/g、32.83 mg/100 g、23.31 mg/100 g、5.2×106CFU/mL。3 结论

在单因素试验基础上，利用响应面优化圣女果百香果复合发酵饮料工艺参数。结果表明，各因素对圣女果百香果复合发酵饮料中感官评分影响大小依次为果汁配比、发酵时间、菌种添加量、发酵温度；最优发酵工艺条件为：圣女果∶百香果汁配比6∶1、发酵时间31 h、菌种添加量3%、发酵温度37 ℃。在此发酵条件下，圣女果百香果复合发酵饮料感官评分达82分，呈橘红色、色泽光亮，具有圣女果、百香果固有香味，风味独特，酸甜适口。发酵后复合发酵饮料的pH、可溶性固形物、总酸、还原糖、总酚、总黄酮、番茄红素、维生素C、乳酸菌总数分别为3.30、11.50%、5.95 g/100 mL、6.68 g/100 g、40.03 mg/100 g、6.83 mg/g、32.83 mg/100 g、23.31 mg/100 g、5.2×106CFU/mL。为进一步开发兼具圣女果与百香果复合香味、营养丰富、保健功效的植物型乳酸发酵产品提供参考依据。