响应面法优化金银花枸杞风味酸奶的发酵工艺

成 堃，袁雪娇，高 星，蔡晓明，井海荣

（齐鲁理工学院 化学与生物工程学院，山东 济南 250200）

金银花（Lonicera japonica）又名忍冬，是清热解毒、疏散风热的良药，具有抑菌、保肝、抗氧化等药理活性[1-3]。2002年，原卫生部印发了《既是食品又是药品的物品名单》，明确了金银花属于药食两用物质。以金银花为原料研发的保健饮品兼具消暑解渴和保健的功效，如金银花菊花甘草复合保健凉茶[4]、鱼腥草金银花凉茶[5]、决明子枸杞金银花复合饮料[6]等。

枸杞是传统的名贵中药材，药食两用，具有多种药用与营养价值[7]，在饮料、保健饮品、食品中有重要的用途。目前以枸杞为原料开发的产品有枸杞山药百合复合饮料[8]、枸杞覆盆子果醋[9]、枸杞桂圆复合饮料[10]、枸杞菠萝复合果酒[11]、灵芝枇杷花复方口服液[12]、桃胶枸杞新型营养果冻[13]等。

风味酸奶营养丰富，口味多样，尤其受到儿童、学生、都市白领等年轻消费人群的喜爱。已经报道的风味酸奶中，根据原料的不同，主要有水果酸奶、谷物酸奶、蔬菜酸奶等。中药是我国古代科学的瑰宝，以药食两用中药为原料开发的酸奶日益增多。如方芳等[14]用芦根、莲子心、百合、鸡内金、天冬研制出一种功能性酸奶，极大的提高了酸奶的品质；赵翾等[15]开发出一款火麻仁中药型酸奶，具有通便润肠、维持肠道菌群平衡、预防便秘的功能；张建萍等[16]研制的白果山楂酸奶营养丰富，具有开胃消食等功效。

本研究以金银花、枸杞为原料，利用响应面法优化了金银花枸杞风味酸奶的发酵工艺条件，不仅增加了风味酸奶的品种，也为金银花的开发利用提供了一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂奶粉、枸杞、白砂糖：市售；金银花：购于中药店；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：齐鲁理工学院化学与生物工程实验教学中心保藏。

1.2 仪器与设备

美的WBL2521H榨汁机：广东美的生活电器制造有限公司；HHW.21电热恒温水浴锅：北京永光明医疗仪器厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；GNP-9050型隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金银花枸杞风味酸奶发酵工艺

全脂奶（10%）→配料（金银花汁，枸杞汁，白砂糖）→预热，均质→杀菌（90 ℃，10 min）→冷却（室温）→接种→发酵（42 ℃，5 h）→冷藏后熟（4 ℃，12 h）→成品

1.3.2 操作要点

（1）金银花汁、枸杞汁的制备

称取5 g金银花，加入100 mL蒸馏水，电磁炉上煎煮30 min；冷却后纱布过滤，用少量水多次洗药渣后收集滤液，定容至100 mL。

称取10 g枸杞，用100 mL自来水浸泡过夜，榨汁机打浆，纱布过滤得滤液。

（2）母发酵剂的制备[17]

用接种针挑取保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的适量菌体，分别接入MRS液体培养基试管中，37 ℃培养2 d，调整培养液的菌浓至1×106个/mL。将全脂奶（10%）分装试管、三角瓶，115 ℃保温30 min。向试管中接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的菌悬液各1 mL，42 ℃培养至全脂奶出现凝乳；然后按照10%的接种量向三角瓶中接入上述培养物，42 ℃培养至全脂奶酸度为70～75°T，作为母发酵剂[17]。

1.3.3 金银花枸杞风味酸奶发酵工艺的单因素试验

选取金银花汁添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、枸杞汁添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵温度（38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃）、发酵时间（3 h、5 h、7 h、9 h、11 h）、发酵剂接种量（5%、10%、15%、20%、25%）进行单因素试验，每组试验做3次重复试验，结果取平均值。以感官评分、酸度为评价指标，确定各因素对金银花枸杞风味酸奶质量的影响。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，选择发酵温度（A）、发酵时间（B）、发酵剂接种量（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件，进行发酵工艺条件的响应面优化试验。响应面试验因素与水平见表1。

表1 金银花枸杞风味酸奶发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of honeysucklewolfberry flavor yoghurt

1.3.5 质量指标

（1）金银花枸杞风味酸奶的感官质量品评

金银花枸杞风味酸奶的感官质量品评评分标准见表2。评价指标包括色泽、组织状态、口感、气味四项。感官品评小组由10人组成，根据评价标准，对风味酸奶打分，平均值作为风味酸奶的得分。

表2 金银花枸杞风味酸奶感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt

（2）各指标的检测

脂肪含量、蛋白质含量、酸度、乳酸菌数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、酵母、霉菌等指标均按照国标GB 19302—2010《发酵乳》进行检测[18]。

1.3.6 统计分析

应用Excel软件进行试验数据处理，利用Design-Expert version 8.0.6设计软件进行响应面试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 金银花汁添加量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响

图1 金银花汁添加量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响Fig.1 Effect of honeysuckle juice addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同金银花汁添加量发酵的酸奶感官评分和酸度见图1。由图1可知，添加有金银花汁的酸奶均黏稠，同时有少量乳清析出。当金银花汁添加量为5%、10%时，酸奶呈乳白色，口感酸，有淡淡的中药味，金银花汁添加量10%的酸奶比5%的略苦；当金银花汁添加量超过15%时，酸奶颜色由淡黄色逐渐变为黄色，中药味依次变浓，其中25%的酸奶中药味最浓，口感最苦。总体上看，添加金银花汁后，酸奶的酸度变化较小，且只有添加5%金银花汁发酵出的酸奶有淡淡的酸奶香，口感最好。因此，金银花汁的最适添加量为5%。

2.1.2 枸杞汁添加量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响

图2 枸杞汁添加量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响Fig.2 Effect of wolfberry juice addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同枸杞汁添加量发酵的酸奶感官评分和酸度见图2。由图2可知，当枸杞汁添加量为2%时，酸奶颜色呈乳白色，随着枸杞汁添加量的增加，酸奶颜色逐渐变红，当枸杞汁添加量为10%时，酸奶颜色为淡红色。添加了枸杞汁的酸奶均黏稠、细腻均匀无乳清析出；从风味上看，当枸杞汁添加量为6%时，酸奶香气最协调、浓郁；随着枸杞汁添加量的提高，口感依次变酸，添加10%时口感最酸，不协调。综合色泽、组织状态、口感、气味等特征，枸杞汁的最适添加量为6%。

2.1.3 白砂糖添加量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响

图3 白砂糖添加量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响Fig.3 Effect of sugar addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同白砂糖添加量发酵的酸奶感官评分和酸度见图3。由图3可知，白砂糖一方面作为碳源为微生物生长代谢提供营养物质，同时也作为甜味剂调节酸奶的口感，使发酵出的酸奶酸甜可口。从试验结果看，添加了白砂糖发酵出的酸奶细腻且质地均匀黏稠，酸度变化很小；就口感而言，白砂糖添加量为2%时，酸奶酸味重；当白砂糖添加量为4%、6%时，口味比2%的略好，但是味道寡淡；当白砂糖添加量为8%时，酸甜可口；白砂糖添加量为10%时，酸奶甜味重。因此，白砂糖的最适添加量为8%。这与杨国浩等[19-20]的报道结果相同。

2.1.4 发酵温度对金银花枸杞风味酸奶质量的影响

图4 发酵温度对金银花枸杞风味酸奶质量的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同发酵温度发酵的酸奶感官评分和酸度见图4。由图4可知，发酵温度为38 ℃、40 ℃时，发酵温度略低，酸奶口味偏甜，呈奶液状，不够黏稠；当发酵温度为42 ℃时，酸奶细腻黏稠，酸甜适中，发酵奶香中带有淡淡的中药香，感官评分最高；发酵温度为44 ℃时，酸奶有少量的结块，酸甜不适口；发酵温度为46 ℃时，酸奶质地不均匀，有大量乳清析出，酸味较重。综合感官评分和酸度，确定最适发酵温度为42 ℃。

2.1.5 发酵时间对金银花枸杞风味酸奶质量的影响

图5 发酵时间对金银花枸杞风味酸奶质量的影响Fig.5 Effect of fermentation time on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同发酵时间发酵的酸奶感官评分和酸度见图5。由图5可知，当发酵时间为3 h时，发酵时间过短，酸奶呈奶液状，无发酵乳香，口感甜；发酵时间为5 h时，酸奶质地均匀，细腻黏稠，感官评分最高；随着发酵时间的延长，酸奶的酸度升高，口感逐渐变酸；当发酵时间超过9 h时，酸奶酸味重，有大量乳清析出。因此，最适发酵时间为5 h。

2.1.6 发酵剂接种量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响

图6 发酵剂接种量对金银花枸杞风味酸奶质量的影响Fig.6 Effect of starter inoculum on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同发酵剂接种量发酵的酸奶感官评分和酸度见图6。发酵剂接种量为5%、10%、15%时，酸奶均细腻均匀无杂质，发酵剂接种量为5%时，酸奶口味淡薄；接种量为10%时，口感略甜；接种量为15%时，酸甜可口，口味协调，接种量超过20%时，有大量豆腐脑状蛋白沉淀，口感粗糙有杂质；因此，发酵剂最适接种量为15%。

2.2 响应面法优化工艺条件

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果，使用Design-Expert 8.0.6软件，以感官评分（Y）为响应值，选择发酵温度（A）、发酵时间（B）、发酵剂接种量（C）为自变量，设计了3因素3水平响应面试验组，试验设计与结果见表3，显著性检验和方差分析结果见表4。

表3 金银花枸杞风味酸奶发酵工艺优化响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of yoghurt

2.2.2 模型的建立及方差分析

用Design-Expert 8.0.6软件将模型进行分析，得到金银花枸杞风味酸奶的感官评分以及所选3个因素编码值的回归方程为：

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4知，失拟项P=0.839 5，说明相对于纯误差失拟不显著（P＞0.05）。模型P＜0.000 1说明模型极显著。获得模型决定系数R2=0.998 1，说明该模型99.81%的数据可用此方程解释。模型的变异系数（coefficient of variation，CV）相对较低（0.60%），说明该实验值有很高的精密度及可靠性。综上所述，该模型拟合度符合数理统计学原则，金银花枸杞风味酸奶的工艺可以用此方程预测。根据F值的大小，得出金银花枸杞风味酸奶感官评分受各因素的影响次序为：发酵剂接种量（C）＞发酵温度（A）＞发酵时间（B）。除了二次项C2对感官评分无显著影响外，其他项A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2对金银花枸杞风味酸奶的感官评分影响极显著（P＜0.01）。

2.2.3 响应面分析与最优工艺验证

利用Design-Expert 8.0.6软件，作出以感官评分为响应值的各因素的响应曲面图和等高线图，并分析各因素的交互作用，结果见图7。由图7可知，发酵温度（A）与发酵时间（B）、发酵温度（A）与母发酵剂接种量（C）、发酵时间（B）与母发酵剂接种量（C）的椭圆度都很大，说明AB、AC、BC的交互影响都极显著（P＜0.01）；综合分析发现，发酵温度（A）与发酵时间（B）的交互影响最显著。

图7 发酵温度、发酵时间与母发酵剂接种量交互作用对金银花枸杞风味酸奶感官评分影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and starter inoculum on sensory score of honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt

由软件分析得金银花枸杞风味酸奶的最优发酵工艺条件为发酵时间5.08 h，发酵温度42.72 ℃，母发酵剂接种量10%；在该最优条件下，酸奶的感官评分预测值为91.31分。考虑到实际生产，将最优发酵工艺条件参数调整为发酵时间5.1 h、发酵温度43 ℃、发酵剂接种量10%。按优化的发酵条件进行3次重复试验，结果取平均值，得到酸奶的感官评分实际值为91分，说明最优发酵工艺条件可靠。

2.3 产品指标

发酵出的金银花枸杞风味酸奶呈淡橙色，凝乳均匀，细腻无杂质；酸甜可口；酸奶有金银花特有的药香。蛋白质含量为2.3 g/100 g，脂肪含量为2.6 g/100 g，酸度为76°T。

金银花枸杞风味酸奶中乳酸菌数为1.1×106CFU/mL，未检出大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，霉菌数＜1 CFU/mL，酵母数＜1 CFU/mL。

3 结论

通过单因素试验优化了金银花枸杞风味酸奶的配方，响应面法优化了金银花枸杞风味酸奶的发酵工艺条件。结果表明，金银花汁添加量为5%，枸杞汁添加量为6%，白砂糖添加量为8%，发酵温度为43 ℃，发酵时间为5.1 h，母发酵剂接种量为10%。在此工艺条件下，发酵出的金银花枸杞风味酸奶感官评分为91分，酸度为76°T。金银花枸杞风味酸奶色泽均匀，酸甜适口，质地细腻，有金银花特有的药香，感官指标、理化指标和微生物指标均符合国家标准。