大鼠骨骼肌急性损伤后早期运动训练和按摩对肌卫星细胞增殖相关因子的影响

贺舟，常青，唐成林，朱正威

1.重庆医科大学附属康复医院，重庆市 400016；2.重庆医科大学体育医学院，重庆市 400016；3.重庆医科大学中医药学院，重庆市 400016

骨骼肌损伤是运动员在运动、训练中最为常见的运动损伤，其中又以急性骨骼肌钝挫伤较为常见[1]。我国运动员训练过程中肌肉挫伤的概率达50%～70%[2]；高校体育运动损伤中轻度损伤占14.53%，中度损伤占60.66%[3]。骨骼肌损伤治疗通常在损伤24 h后才开始介入，在损伤后24 h 内缺乏有效治疗措施。本研究探索骨骼肌损伤24 h 内介入治疗对骨骼肌卫星细胞增殖分化信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

8 周龄SPF 级健康成年雄性Sprague‐Dawley 大鼠40 只，体质量(200±20) g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK 渝2018‐0003。实验过程中所有动物相关的处理严格按照国际动物伦理准则和使用指南的相关规定。分笼饲养，每笼4 只，室温(21±2)℃，相对湿度65%～75%，自由饮水，标准饲料喂养，自然光照。适应性喂养1 周后，随机抽样法分为A、B、C、D、E共5组，每组8只。

1.2 主要试剂及仪器

磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated mito‐gen‐activated protein kinase,p‐MAPK)一抗、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶(phosphorylated mitogen‐acti‐vated protein kinase kinase,p‐MEK)一抗、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases p‐ERK)1/2 一抗、胰岛素样生长因子‐1(insulin‐like growth factor‐1,IGF‐1)一抗：重庆茂缙生物技术有限公司。Western blotting 试剂：上海碧云天生物技术有限公司。mmobilonTMWestern Chemilumi‐nescent HRP Substrate 发 光 液：美 国MILLIPORE 公司。Trizol 总RNA 提取液、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、RR037A 逆转录试剂盒、引物合成：日本TAKARA 公司。AL204 型电子天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司。电泳仪、电转仪、T100TM聚合酶链反应(poly‐merase chain reaction,PCR)仪和CFX ConnectTM荧光定量PCR 检测系统：美国BIO‐RAD 公司。低温离心机：日本SIGMA 公司。凝胶图像扫描及分析系统：北京赛智科技公司。ThermoND2000 超微量核酸蛋白测定仪：上海GENE 公司。DP73 拍摄装置：日本OLYM‐PUS 公司。自制动物模型打击装置：上方为直径22 mm、长250 mm 铝管，下方为直径12 mm、长100 mm 铝管，里面套有直径10 mm、长150 mm 木棍。图像采集系统等由重庆医科大学中医药学院提供。

1.3 动物模型制备与评价

B～E 组参照杨辉等[4]的方法造模并进行改良。打击装置的木棍紧贴大鼠右小腿内侧面(其下为腓肠肌中段)，将直径20 mm、长170 mm、质量640 g的实心钢柱体从高250 mm 处下落，打击套在下方空心铝管中的木棍，造成腓肠肌急性挫伤模型。实心钢柱体的投放和大鼠的固定均由专人操作。造模后观察大鼠行走跛行且造模侧有明显肿胀，为造模成功。

1.4 干预方法

C组和E组于造模后24 h内介入按摩，专人操作。大鼠侧卧位固定，套头套，待其情绪稳定后用拇指揉法按摩伤处，以按摩部位肌肉下陷且大鼠保持安静状态的刺激量为准，否则停止按摩，待其安静后继续治疗；按摩手法应缓和、均匀且持久，约120～140 次/min[5]，持续10 min。B 组仅套头套，不予任何干预。D 组和E 组于造模后24 h 内参照高尚等[6]的训练方案介入跑台运动训练1次，速度13 m/min，持续20 min。见表1。

1.5 取材

造模后24 h，大鼠以4%水合氯醛0.8 ml/kg 腹腔注射麻醉，右腿保持造模时姿势，于坐骨结节处用齿镊提起皮肤，圆剪切皮肤至跟腱处，分离皮肤和其他肌肉组织，在跟腱处剪断跟腱并翻折180°，除去比目鱼肌，剪下完整腓肠肌，0.9%氯化钠溶液冲洗。迅速放入液氮罐中速冻，-80 ℃冰箱储存，分别用于West‐ern blotting 检测和PCR 检测。部分组织4%多聚甲醛固定包埋，用于HE染色。

1.6 HE染色

腓肠肌组织4%多聚甲醛固定48～72 h后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5 μm；二甲苯脱蜡，蒸馏水水化，苏木精染色，1%盐酸‐乙醇分化，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，400倍光镜下观察。

1.7 Western blotting

各只大鼠取30～50 mg 组织，剪碎后加入适量蛋白裂解液蛋白酶抑制剂匀浆后配平，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清；ABC 法蛋白定量，95 ℃10 min 变性；SDS‐PAGE 恒压电泳，移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉常温封闭2 h，TBST 洗膜，分别加p‐MAPK(1 ∶500)、p‐MEK(1 ∶1000)、p‐ERK1/2 (1∶1000)和GAPDH (1∶5000)一抗孵育，4 ℃摇床过夜；TBST洗膜，加入5%脱脂奶粉稀释的二抗，摇床常温反应1 h，TBST 洗膜，加入发光液TCL 显色，3 min后凝胶成像系统成像。Image J 软件定量分析，GAP‐DH 作内参，以目的条带光密度值和内参条带光密度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.8 PCR

取腓肠肌组织50 mg 剪碎，移入1.5 ml无酶EP 管中，加Trizol 试剂1 ml 匀浆，提取总RNA。取总RNA 2 μl 稀释50 倍，紫外分光光度计测定260 nm/280 nm 处光密度值比值。加样完全后，充分混匀，简短离心；参照ReverTre Ace‐α‐反转录试剂盒说明书进行c‐DNA 制备，并行PCR 反应；取PCR 产物15 μl 加入上样孔，5 V/cm 电泳(事先制备好琼脂糖凝胶)，凝胶成像系统成像，Quantity One 计算荧光值；结果以MyoD1/β‐actin和MyoG/β‐actin的比值表示。

引物序列如下[1]。

MyoD1：上游5'‐CGC CTG AGC AAA GTG AAC GA‐3'；下 游5'‐CAG ACC TTC AAT GTA GCG GAT G‐3'。

MyoG：上 游5'‐CCA GAC TAC CCA CCG TCC ATT‐3'；下游5'‐CTG AGT TTG CCC CGT TGA GG‐3'。

β‐actin：上游5'‐ACC CCG TGC TGC TGA CCG AG‐3'；下游5'‐TCC CGG CCA GCC AGG TCC A‐3'。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据处理。计量资料用()表示，组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD法分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色

A 组腓肠肌纤维大小一致，呈多边形，排列整齐，细胞核分布于肌细胞边缘，颜色及形态均正常；B 组肌纤维肿胀、碎解，炎症细胞浸润，细胞排列紊乱。C～E 组较B 组肌纤维肿胀好转，细胞排列整齐，但各干预组镜下表现无明显差别，均呈细胞肿胀，少量细胞破裂，炎性细胞浸润，红细胞聚集。见图1。

2.2 Western blotting

C～E 组p‐MAPK、p‐MEK 和p‐ERK1/2 蛋白表达大多较A 组和B 组升高(P＜0.05)，其中D 组最高；A组IGF‐1 高于其他各组(P＜0.05)，C～E 组中，D 组最低。见图2、表1。

2.3 PCR

B～E 组MyoD1 mRNA 表达水平均较A组升高(P＜0.05)，且C～E 组较B 组升高(P＜0.05)；C～E 组中，C 组最高，D 组次之，E 组最低。B～E 组MyoG mRNA 表达水平均较A 组升高(P＜0.05)，但C～E组较B 组降低(P＜0.05)；C～E 组中，E 组最高，D 组次之，C组最低(P＜0.05)。见表2。

图1 各组大鼠腓肠肌(HE染色，bar=50 μm)

图2 各组腓肠肌IGF-1、p-MAPK、p-MEK和p-ERK1/2的Western blotting

3 讨论

骨骼肌损伤在运动员比赛或训练中十分常见，自然恢复时间较长，且不一定能完全恢复。目前治疗主要建议患者采用常规治疗方法简称RICE 原则，即休息(rest)、冰敷(ice)、压迫(compression)、抬高(eleva‐sion)，以减轻损伤部位早期肿胀[7]。治疗后瘢痕修复较为普遍，修复部位运动能力下降，再损伤概率达44%[8]。有研究建议代之以POLICE 原则，即用保护(protest)和适当负重(optimal loading)代替休息[9‐11]，强调在骨骼肌损伤后早期应给予适当的运动训练，促进骨骼肌恢复。骨骼肌损伤在一定程度下，具有再生修复的能力[12]。如何更快更好地促进受损骨骼肌愈合，是目前运动医学领域的研究热点。

骨骼肌损伤后的修复过程极其复杂，可人为划分为没有明显时间界限的3 个阶段，即炎症反应、损伤修复、组织塑形[5,13‐14]，涉及多种细胞因子和信号通路的共同调节[15‐16]。修复过程中除依靠内源性肌卫星细胞外，还必须有生长因子和适当的刺激[17‐18]，其中IGF‐1 在骨骼肌损伤修复中起重要作用[19]。肌肉受运动或外界刺激时，IGF‐1 表达水平升高，诱导局部组织蛋白质合成，防止细胞凋亡。IGF‐1 主要通过激活MAPK/MEK/ERK1/2 信号通路调控骨骼肌损伤修复[20‐21]。IGF‐1可促进肌细胞增殖和骨骼肌质量增加[5]。Hill 等[16]发现，骨骼肌损伤后IGF‐1 mRNA 表达显著增加。IGF‐1 对肌细胞的有丝分裂作用主要由MAPK通路途径介导[22]。MAPK 途径与细胞增殖、分化、代谢等生理活动密切相关，目前发现至少3 种激酶，涉及4 种信号转导。其中MAPK/ERK 通路也称Ras‐Raf‐MEK‐ERK 通路，通过接受细胞表面受体信号转导，促进细胞增殖[23]。生理条件下，为了维持细胞生长和体内平衡，体内多个反馈机制参与调节这一信号通路的活性。当上游受体被激活时，Ras 被激活，随后活化 的Raf 将MEK 磷 酸 化，p‐MEK 又将ERK 磷酸化。ERK 参与许多底物磷酸化，参与调节细胞周期、分化和细胞凋亡等一系列生理活动。

表1 各组腓肠肌IGF-1、p-MAPK、p-MEK和p-ERK1/2表达(/GAPDH)

表2 各组腓肠肌MyoD1和MyoG mRNA表达(/β‐actin)

骨骼肌卫星细胞的活化、增殖和分化主要依靠骨骼肌特异性转录因子MyoD和MyoG的调节[24]。MyoD主要在活化的肌卫星细胞中表达，是骨骼肌卫星细胞活化标志[25]；MyoG 则在胚胎期和新生儿期骨骼肌发育过程中与肌纤维形成有关，可能与骨骼肌成肌细胞的分化、融合为肌管的过程有关，是骨骼肌卫星细胞分化的标志[26]。MyoD 和MyoG 分别参与骨骼肌成肌前体细胞的增殖与分化[27]。

本团队前期从骨骼肌急性损伤后的修复机制、前期炎症、后期修复等做了大量的前期实验研究[28]，发现跑台运动能显著提高骨骼肌卫星细胞中多种因子表达，促进大鼠腓肠肌损伤的修复[29‐31]。本研究显示，在骨骼肌损伤后24 h 内介入干预，有助于骨骼肌形态学恢复；损伤早期介入跑台运动和按摩均对骨骼肌损伤后MAPK/MEK 通路有促进作用，其中联合训练并不优于单纯干预，尤以跑台运动干预效果最为显著；但按摩对IGF‐1 的表达效果最佳，而跑台运动反而降低IGF‐1 的表达。Kraener[32]研究显示，急性运动和慢性运动后对IGF‐1 的表达均无显著性影响[33]。在骨骼肌受到机械负荷刺激后，不同表型IGF‐1 表达水平有异，其中明显升高的只是其异构体机械生长因子(mechano growth factor,MGF)。运动后，MGF 表达先于IGF‐1[34]。结合本研究结果，提示跑台运动训练应以耐力训练为主，可能会较好刺激IGF‐1 表达，同时应早期检测MGF的表达水平。

本研究显示，损伤后24 h内干预，可促进MyoD1表达，尤以按摩效果最为明显，跑台运动次之。主要可能与IGF‐1的表达量升高。IGF‐1在介导骨骼肌卫星细胞增殖、分化和蛋白质合成降解过程中，通过多种信号通路发挥作用。既通过MAPK/MEK 信号途径诱导肌卫星细胞增殖，也可通过促进MyoD 和p21 的表达，参与诱导成肌细胞增殖分化[35]。MyoG 的表达在模型组升高最为明显，干预各组均呈降低趋势，MyoD1 与MyoG 的表达具有相对性，与Muller 等[36]研究结果一致，也与Sakuma 等[37]关于快肌和慢肌中MyoD 与MyoG 表达不一致的研究结果一致。腓肠肌纤维主要由Ⅱ型肌纤维组成，属于快肌[38]，MyoD的表达要高于MyoG。

综上所述，骨骼肌急性损伤后24 h 内介入跑台运动能有效提高肌肉组织中p‐MAPK、p‐MEK、p‐ERK1/2 的表达，通过激活MAPK/MEK 通路促进肌卫星细胞增殖、分化和肌管融合，加快肌肉组织修复，其效果优于按摩；但按摩可能针对更为广泛的信号通路发挥作用。本团队以前的研究发现[29]，骨骼肌损伤24 h 后介入跑台运动和按摩干预，联合干预效果优于单一干预。还有待进一步研究。

以往治疗骨骼肌损伤都是在损伤后24 h 后介入，本研究于骨骼肌损伤后24 h 内干预是一个全新的尝试。损伤后早期介入干预，可促进MAPK/MEK 通路的激活，而MAPK/MEK 通路是骨骼肌卫星细胞增殖分化的重要影响因素，并对抑制骨骼肌纤维化有积极作用[8]。早期介入有可能避免运动员损伤后的瘢痕修复及其带来的运动能力下降，值得进一步研究。