巴戟天采后储存温度和时间对寡糖类成分的影响△

孙恬，刘凤松，杨丽，冯冲，丁平*

1.天方健(中国)药业有限公司，广东 广州 510623；2.无限极(中国)有限公司，广东 广州 510623；3.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006

巴戟天药材为茜草科植物巴戟天MorindaofficinalisHow 的干燥根，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效[1]。巴戟天是广东省道地药材，也是我国著名的“四大南药”之一，作为滋补肾阳药在中国已有2000多年的历史。现代研究表明，巴戟天中主要含有寡糖、蒽醌、环烯醚萜等成分[2]，其中寡糖类化合物为巴戟天中的主要成分，占生药材的40%以上[3]，具有抗抑郁、改善生殖、神经保护等多方面的药理作用[4-7]。巴戟天中的寡糖为菊淀粉型(inulin)，其结构为若干个果糖单元以β-(2→1)-键连接，末端连接蔗糖残基[8]。有文献表明，含有inulin型寡糖的植物，例如洋姜、牛蒡，在收获后的储存过程中，高聚合度(degree of polymerization，DP)的糖含量会减少，而蔗糖和低DP的糖含量会增加，说明长期储存会不可避免地影响inulin的成分，例如长链糖降解为短链糖[9-10]。为了解巴戟天采收后储存的温度和时间会对巴戟天中的inulin型寡糖造成何种影响，本研究利用HPLC-ELSD法测定了巴戟天鲜品储存过程中(25、4、-7 ℃条件下分别储存1～56 d)寡糖类成分的含量，得出各成分随储存温度和时间的变化规律，进而为巴戟天采收后储存方法的确立提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Unimicro EasySepTM-1020高效液相色谱仪，UM5000蒸发光散射检测器(上海通微分析技术有限公司)，N2000双通道色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)，Precisa XR 205 SM-DR电子分析天平(精度=0.01 mg，瑞士Precisa公司)，Sartorius电子分析天平(精度=0.1 mg，瑞士Sartorius公司)，DFT-200高速万能粉碎机(25 000 r·min-1，温岭市林大机械有限公司)，CQ-200超声波清洗器(功率200 W，频率40 kHz，上海音波声电科技公司)，LD4-2A低速离心机(转速3000 r·min-1，北京医用离心机厂)。

1.2 试药

乙腈(色谱纯，美国ACS化学试剂公司)，三乙胺(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，乙醇为分析纯，水为去离子水。

对照品：D-果糖(D-fructose，批号：SS0905GA14)、D(+)-无水葡萄糖[D(+)-glucose，批号：SA0418GA14]、蔗糖(sucrose，批号：TF0226CA14)购自上海源叶生物科技有限公司；1-蔗果三糖(1-kestose，批号：AWG0714)、耐斯糖(nystose，批号：AWG0714)、1F-果呋喃糖基耐斯糖(1F-fructofuranosylnystose，批号：AWG0714)购自日本和光(Wako)纯药工业株式会社，纯度均大于98%。

样品：巴戟天(4年生)收集于广东省德庆县高良镇，经广州中医药大学丁平研究员鉴定为巴戟天MorindaofficinalisHow的新鲜根，凭证标本存放于广州中医药大学中药资源教研室。样品处理方法如下：将新鲜巴戟天(20170924)采收后，立即除去泥土(不用水洗)及须根，将样品随机、平均分成4份，每份1000 g，装入不锈钢托盘中，分别置于25 ℃(室温，相对湿度 55%)、4 ℃(冰箱冷藏室，相对湿度24%)、-7 ℃(冰箱软冻温区，相对湿度30%)保存，分别于第1、3、6、14、21、28、42、56天(共8周)取样，每次约100 g，立即测定各样品中的水分及寡糖类成分的含量，并按干燥品计算各成分的实际含量。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性考察

色谱柱：Waters XBridgeTMAmide(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流动相：0.2%三乙胺乙腈(A)-0.2%三乙胺水溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，75%～70%A；10～20 min，70%A；20～45 min，70%～60%A；45～60 min，60%A；60～63 min，60%～75%A)；体积流量：0.8 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；蒸发光散射检测器(ELSD)漂移管温度：75 ℃；氮气流量：2.5 L·min-1。在此条件下，主峰保留时间适中，各色谱峰理论塔板数均不<9000，D-果糖、D(+)-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖与相邻色谱峰的分离度均>1.5，符合《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)的要求。空白溶液、混合对照品、巴戟天寡糖供试品溶液HPLC-ELSD(25 ℃-14 d)图见图1。

注：1.D-果糖；2.D(+)-无水葡萄糖；3.蔗糖；4.1-蔗果三糖；5.耐斯糖；6.1F-果呋喃糖基耐斯糖；A.空白溶剂；B.混合对照品；C.供试品。图1 空白溶剂、混合对照品、巴戟天供试品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取D(+)-无水葡萄糖、D-果糖、1-蔗果三糖、蔗糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖(减压干燥24 h)适量，50%乙腈定容，制成含D-果糖1.378 mg·mL-1、D(+)-无水葡萄糖0.828 mg·mL-1、蔗糖1.210 mg·mL-1、1-蔗果三糖0.832 mg·mL-1、耐斯糖1.280 mg·mL-1、1F-果呋喃糖基耐斯糖1.658 mg·mL-1的混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

将新鲜巴戟天打碎，过2号筛，精密称取不同储存温度和时间的样品2.0 g(当样品水分低于40%后取样1.0 g)，置具塞锥形瓶中，加入体积分数50%乙醇50 mL，称定质量，静置20 min，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)20 min，再次称定质量，以体积分数50%乙醇补质量，摇匀，于3000 r·min-1离心(离心半径15 cm)10 min，取上清液以0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1线性关系考察 精密吸取2.2项下混合对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于1 mL量瓶中，加入50%乙醇溶液定容，得到6个不同浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取上述溶液20 μL，按2.1中条件进行分析，以混合对照品进样质量的对数值 (X)为横坐标，以其峰面积积分的对数值为纵坐标(Y)，建立回归方程。其回归方程、线性范围及相关系数(n=3)见表1，表明D-果糖等6种寡糖在相应的线性范围内呈良好的线性关系。

表1 6种寡糖类成分的回归方程及线性范围

2.4.2精密度试验 取巴戟天(25 ℃-14 d)，按2.2方法制备，同一日内连续进样6次，记录D(+)-无水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面积，进行计算，上述6种成分峰面积的RSD为1.91%～4.73%。取同一供试品溶液(25 ℃-14 d)，连续3 d内每日进样3次，记录D(+)-无水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面积，上述6种成分峰面积的RSD为2.29%～3.90%，表明精密度良好。

2.4.3稳定性试验 取同一供试品(25 ℃-14 d)，按2.3方法制备，室温放置，分别于0、2.5、5、7.5、10、12.5、24、48、72 h按照2.1项下色谱条件进样分析，记录D(+)-无水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面积及RSD，上述6种成分峰面积的RSD为1.77%～3.51%，表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.4.4重复性试验 取同一供试品(25 ℃-14 d)6份，按2.2方法制备，按2.3中条件进行分析，测得D(+)-无水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面积，并计算各成分的含量。上述6种成分含量的RSD为2.20%～2.68%，表明该方法重复性良好。

2.4.5加样回收率试验 精密称取已知含量供试品(25 ℃-14 d)共9份，每份1.0 g，分别加入每1 mL分别含D-果糖4.080 mg、D(+)-无水葡萄糖1.880 mg、蔗糖3.980 mg、1-蔗果三糖2.520 mg、耐斯糖6.220 mg、1F-果呋喃糖基耐斯糖7.650 mg的混合对照品溶液1、2、3 mL(各3份)，按照2.3项下方法制备供试品溶液，测得D-果糖、D(+)-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的平均回收率(n=9)分别为97.28%、97.90%、101.00%、101.69%、99.79%、101.29%，RSD分别为2.25%、2.08%、2.01%、1.92%、2.36%、1.78%。

2.5 巴戟天中水分测定

巴戟天采收后，在25 ℃条件下储存是一个阴干的过程，14 d后样品成干燥状态，连珠状明显，无霉变现象；在4 ℃条件下，巴戟天一直保持新鲜状态；而在-7、-18 ℃条件下，样品逐渐冷冻变硬，表面结霜，其他外观性状保持不变。不同储存温度、储存时间的巴戟天鲜品中的水分按《中华人民共和国药典》四部通则0832水分测定法第二法(烘干法)测定，结果见表2。

2.6 巴戟天寡糖含量测定

按2.3项方法制备供试品溶液，每个样品平行制备3份，按2.1项色谱条件下进样测定，计算不同储存温度、储存时间的巴戟天各样品中D-果糖、D(+)-无水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量(按干燥品计算)，结果见表3。

因巴戟天中DP 6～10 的寡糖尚无对照品，不能进行定量计算，故以峰面积为指标，推断其含量变化，结果见表4。

表2 巴戟天在不同温度中储存1～56 d的水分测定结果

表3 不同储存条件下巴戟天中6种寡糖的质量分数 mg·g-1

表4 25 ℃下巴戟天中DP 6～10寡糖的峰面积

2.7 储存温度和储存时间对寡糖类成分的影响

表3中可看出，在25 ℃条件下，蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖(DP分别为3、4、5)的寡糖含量逐渐下降，说明巴戟天在常温下储存时，由于巴戟天药材中尚存在有水分，所以DP为3～5的寡糖会慢慢水解，导致果糖、葡萄糖和蔗糖则含量逐渐增加；4、-7 ℃条件下存放，上述几种寡糖含量基本稳定。

表4中可以看出，25 ℃条件下，DP 6～10 的寡糖含量并没有降低，反而增加，说明巴戟天在常温下储存时，DP 6～10 的寡糖未发生水解。

3 讨论

巴戟天中的寡糖类成分没有紫外吸收，不适宜用传统的紫外检测器进行定性定量分析，而蒸发光散射检测器(ELSD)可以弥补这方面的不足。本研究考察了Waters XBridge Amide、Thermo APS-2 HYPERSIL、Ecosil 120-5 Amino等色谱柱的分离效果，其中Waters XBridge Amide色谱柱对D-果糖等6种待测成分的分离效果最好，各成分保留时间适中，基线平，噪音低，故选择该色谱柱进行含量测定。另外考察了乙腈-水和含不同浓度三乙胺的乙腈-水溶液作为流动相的分离效果，结果表明，在乙腈和水加入等量的三乙胺(0.2%)时，各成分的分离效果最好，且有利于有机相和水相的均匀混合及系统pH的稳定。

新鲜巴戟天储存过程中，温度条件的不同会对寡糖类成分造成不同的影响。其中25 ℃的储存环境为室温通风状态，室内平均气温约25 ℃，与采收后阴干的环境相似，结合水分及寡糖含量测定结果，该条件下储存1～6 d巴戟天水分从68.10%降至38.72%，期间DP 3～5的寡糖含量下降了25%以上，说明该温度条件下，水分含量较高时巴戟天中DP较高的寡糖会发生水解，例如耐斯糖可脱去1分子果糖生成蔗果三糖，蔗果三糖水解可脱去1分子果糖生成蔗糖，进而导致DP较低的果糖、蔗糖含量升高；而储存14 d后，其水分多低于15%，达到《中国药典》中巴戟天水分限量标准，水解反应缓慢，各成分的含量变化较小。4 ℃条件下，巴戟天一直处于保鲜状态，大部分的酶促反应和化学反应减弱或停止，因此寡糖含量变化较小，与文献[9]结果一致。-7 ℃的储存环境为冰箱的软冷冻区，储存第3 d的巴戟天中DP 3～5寡糖含量骤降，而果糖含量增加，可能是新鲜巴戟天遇到低温后的应激状态，有文献报道，在干旱和低温等逆境条件下，果聚糖释放可溶性果糖，以调节细胞渗透压，是植物参与抵抗渗透胁迫的重要表现[11]。

25 ℃条件下，随着储存时间的增加，巴戟天中DP 6～10 的寡糖含量未水解，反而出现增长的趋势，具体原因有待进一步探究。

巴戟天中抗抑郁的活性成分主要是耐斯糖[4]，根据本研究所得结果，为防止巴戟天中耐斯糖的水解，建议巴戟天采收后快速干燥(可采用60 ℃鼓风干燥)或低温保存(4 ℃)。