HPLC同时测定虎杖根不同部位中的5种活性成分△

孔德暄，朱映睿，朱蔚然，傅敏，王光忠，2*

1.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065；2.湖北省中药炮制工程技术研究中心，湖北 武汉 430065

虎杖为蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎和根。具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。可用于湿热黄疸，风湿痹痛，跌打损伤，肺热咳嗽等病症[1]。现代研究发现，虎杖具有抗炎、抗菌、抗血栓、保护心肌、抗氧化、抗肿瘤等作用[2-6]，其主要含有二苯乙烯、蒽醌及黄酮类等成分，其中二苯乙烯类主要有白藜芦醇和虎杖苷及其衍生物；蒽醌类成分主要有大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素-8-单甲醚、蒽苷A、蒽苷B等；黄酮类成分主要有槲皮素及其苷等[7]。2015版《中华人民共和国药典》中虎杖药材和饮片以虎杖苷、大黄素的含量作为控制质量的标准之一[1]，相关文献报道也多数对虎杖中的大黄素、虎杖苷及白藜芦醇的含量进行检测[8-9]，但是虎杖中还含有很多其他的有效成分，只选两三个有效成分并不能全面控制虎杖的质量。

近年来，随着人们对虎杖中主要活性成分白黎芦醇研究的不断深入，其开发利用的领域在不断扩展，资源消耗量日渐增大。虎杖的应用包括根(皮、木质部)、根茎(皮、木质部)、茎、叶等部位，不同部位质地、色泽、成分和作用均有差异。为此，本研究围绕虎杖根、根茎药用部位中含有的虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚等主要活性成分的分布进行分析评价[10-11]，旨在为虎杖资源的科学合理利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪(VWD检测器)；Agilent Extend C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；SK7200HP超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；XSE105DU十万分之一分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；AL204万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试药

虎杖(批号分别为：151201、151202、151203、181012、181013、181014，采自湖北省房县)，经湖北中医药大学生生药教研室余坤教授鉴定为蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎和根。虎杖苷(批号：H-012-161216，纯度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；白藜芦醇(批号：B-002-170426，纯度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(批号：D-018-171216，纯度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；大黄素(批号：151215，纯度≥98.0%，四川省维克奇生物科技有限公司)；大黄素甲醚(批号：151024，纯度≥98.0%，四川省维克奇生物科技有限公司)。水为重蒸馏水，乙腈、甲醇为色谱级乙腈，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1混合对照品溶液配制 分别称取虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚适量，色谱甲醇溶解，配置成质量浓度分别为1.022、0.203、0.95、0.45、0.48 mg·mL-1的对照品储备液。

分别精密吸取虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚对照品储备液适量，置5 mL容量瓶中，色谱甲醇定容至刻度，摇匀，即得虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚质量浓度分别为204.4、40.6、190.0、90.0、96.0 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液制备 精密称取虎杖样品粉末0.2 g，精密加入60%乙醇25 mL，称质量，超声30 min，冷却，称质量，补足减失质量，滤过，取续滤液过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Extend C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为纯乙腈(A)和水(B)，流速为1 mL·min-1，进样量为10 μL，检测波长为290 nm，柱温为40 ℃。线性梯度洗脱(0～40 min，15.0%～50.0%A；40～60 min，50.0%～90.0%A)。供试品溶液和混合对照品溶液色谱图见图1～2。

注：A.根茎；B.根；C.根茎表皮；D.根表皮；E.根茎木质部；F.根木质部；1.虎杖苷；2.白藜芦醇；3.大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；4.大黄素；5.大黄素甲醚。图1 虎杖不同药用部位色谱图

注：1.虎杖苷；2.白藜芦醇；3.大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；4.大黄素；5.大黄素甲醚。图2 虎杖混合对照品色谱图

2.3 线性范围考察

吸取混合对照品溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL分别置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀。按2.2项下色谱条件不同浓度对照品均进样10 μL，测定峰面积。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程。表1结果表明，5种成分的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，r均大于0.999。

表1 虎杖5种成分检测方法线性范围考察结果

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液1份，进样10 μL，连续进样6次，测得峰面积，计算得虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚RSD分别为0.3%、0.2%、0.4%、0.1%、0.2%，说明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验

取2.1.2项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 μL进行分析，测定峰面积，得虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.8%、0.6%、0.4%、0.3%、1.2%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批样品6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，参照2.2项下色谱条件测定其含量，计算得虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚平均质量分数为17.23、2.13、18.97、7.16、14.82 mg·g-1，其RSD分别为0.9%、0.8%、1.0%、0.7%、0.8%，说明该方法重复性良好。

2.7 加样回收试验

取同一批样品6份，每份0.1 g，精密称定，分别加虎杖苷(1.022 mg·mL-1)1.5 mL、白藜芦醇(0.203 mg·mL-1)1 mL、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(0.95 mg·mL-1)1 mL、大黄素(0.45 mg·mL-1)2 mL、大黄素甲醚(0.48 mg·mL-1)3 mL，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，参照2.2项下色谱条件分别测定峰面积，计算回收率，结果虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素和大黄素甲醚的平均回收率分别为98.8%、98.6%、98.5%、98.4%、98.6%，RSD分别为0.6%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%，结果见表2。

表2 虎杖5种成分加样回收率试验结果(n=6)

续表2

2.8 虎杖中5种化学成分的含量测定

精密量取6份不同批次的样品适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，依次进样分析，测定峰面积，计算虎杖根不同部位中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚的含量，结果见表3。

表3 虎杖不同药用部位5种成分含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

为了提高分析的灵敏度和精确度，本文考察了不同流动相组成(甲醇-水、乙腈-水)对实验结果的影响，结果表明，流动相采用乙腈-水梯度洗脱，能够获得良好的色谱分离效果。采用UV检测器对检测波长进行了考察，根据5种对照品的紫外-可见吸收光谱，虎杖苷和白藜芦醇在310 nm左右有最大吸收，而大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素和大黄素甲醚在290 nm和 440 nm左右有最大吸收。综合考虑，选择290 nm作为检测波长。

3.2 供试品溶液制备的优化

为了使5种活性成分能被更完全地提取出来，本研究对提取溶剂(80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇和甲醇)、提取时间(10、20、30、40 min) 等影响因素进行考察，记录色谱图。结果显示，以60%乙醇为提取溶剂、超声提取 30 min 制备样品的色谱图峰面积相对较大，化合物总含量相对较高，故最终确定供试品的制备方法：60%乙醇超声提取30 min。

本实验对虎杖的根茎、根、根茎表皮、根表皮、根茎木质部、根木质部中的虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚5种活性成分进行了定量分析。结果表明，虎杖苷在根茎表皮中质量分数最高，为72.48 mg·g-1；白藜芦醇和大黄素在根表皮中质量分数最高，分别为8.83 mg·g-1和23.96 mg·g-1；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷在根茎木质部中质量分数最高，为40.57 mg·g-1；大黄素甲醚在根茎木质部中质量分数最高，为17.24 mg·g-1。因此在采收虎杖药材时表皮尽量不要破损，要尽量保存其根及根茎的完整，最大程度上保留虎杖的有效成分。方法学考察结果表明本方法具有很好的重复性、稳定性、精密度和回收率，说明该方法准确、可靠。

白藜芦醇及虎杖苷具有抗肿瘤、降血脂、抑制血小板聚集、调节脂蛋白代谢、保肝、抗氧化、抑菌等多种药理作用，而以大黄素、大黄素甲醚为代表的蒽醌类化合物具有抗菌、保肝、泻下、抗癌等功能[12]。检测分析结果提示，为了更好利用虎杖活性成分、提高疗效，可根据临床需要选择不同部位入药。该研究为虎杖资源的合理利用提供了科学依据。