培养基组成对贝莱斯芽孢杆菌产抑真菌成分的影响

赵鹏鹏，雷淑珍，徐晓光，王蓉，蒋春美，师俊玲

(西北工业大学 生命学院，陕西 西安，710072)

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是目前成功用于实际生产的生防菌之一，能够有效防治由镰刀菌引起的草莓枯萎病、兰花枯萎病等农业病害，对稻瘟病菌、链格孢菌等病菌也有较强的拮抗活性[1-2]。研究发现，该菌能够产生蛋白、 多肽、小分子量抗生素等多种抑菌物质，表现出很好的实际应用效果与前景[3]。

根据已有报道，芽孢杆菌代谢合成抑菌物质的种类与产量与培养基组成和发酵条件紧密有关，通过优化培养基组成，可以显著提高枯草芽孢杆菌发酵产物的抑菌活性[4-5]。亦有报道指出，优化培养基组成能够促进贝莱斯芽孢杆菌的细胞生长与产物合成[6-8]，但针对性提高其抑菌物质产量的相关研究并不多见。

为获得高抑菌活性，特别是抑真菌活性的贝莱斯芽孢杆菌发酵产物，本文较为系统地考察了培养基组成对贝莱斯芽孢杆菌所产抑菌物质种类和活性的影响规律，并优化培养条件，以期为生产提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 微生物

贝莱斯芽孢杆菌由本实验室从土壤中分离获得，并经分子生物学分类鉴定。

1.1.2 培养基

(1)Landy培养基：葡萄糖20.0 g，L-谷氨酸钠5.0 g，蛋白胨10.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.15 mg，MnSO45.0 mg，CuSO40.16 mg，蒸馏水1 000 mL，初始pH为7.0。

(2)营养肉汤培养基(NB)：葡萄糖20.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节初始pH为7.0。

(3)营养肉汤琼脂培养基(NA)：在NB培养基中额外加入20 g/L琼脂，用于贝莱斯芽孢杆菌的保藏与活化。

(4)马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，用于炭黑曲霉的培养。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基种类对贝莱斯芽孢杆菌细胞生长和抑菌活性物质产生的影响

Landy培养基被广泛用于培养芽孢杆菌，NB培养基则是用于培养细菌的常规培养基。分别在这2种培养基(pH 7.0)中接种等量菌种，在32 ℃、160 r/min的条件下培养时间48 h后，离心取菌体，测菌体生物量，以及发酵液的最终pH值和抑菌活性。

1.2.2 培养基组成对抑菌活性物质组成的影响

在Landy培养基中分别加牛肉膏(5 g/L)、NaCl(5 g/L)、蛋白胨(10 g/L)、牛肉膏(5 g/L)+蛋白胨(10 g/L)等NB培养基中营养成分，并以Landy培养基作为对照，在相同条件下培养48 h后，检测菌体生物量，发酵液pH和和抑菌活性。

1.2.3 培养基组成优化

以NB培养基为基础，分别改变其中各组分含量，研究NaCl、牛肉膏、蛋白胨、组合氮源、金属离子和谷氨酸钠对菌体生长和抑菌活性物质产生的影响。实验中所用各因素的水平设置如表1所示。

表1 实验中所用因素与水平

注： 1份离子溶液中含有KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO40.15 mg/L，MnSO45.0 mg/L，CuSO40.16 mg/L

2 结果与分析

2.1 培养基种类对菌体生长与抑菌物质产生的影响

如图1所示，相对于NB培养基，贝莱斯芽孢杆菌在Landy培养基中的最终pH值和细胞生物量较高，但所得发酵液的抑菌圈直径却显著低于NB培养基。

图1 培养基种类对发酵液pH、生物量和抑菌活性物质产生的影响

实验结果说明该菌的细胞生长条件与抑菌物质的产生条件有所不同。相对而言， Landy培养基更有利于贝莱斯芽孢杆菌的菌体生长，而NB培养基则更有利于抑菌活性物质的合成。

2.2 培养基组成对抑菌活性物质组成的影响

如图2所示，牛肉膏、蛋白胨和NaCl的添加能够不同程度地降低发酵液的最终pH值和菌体生长量，同时发酵液中残糖含量较高(4.2 g/L)，说明这些物质抑制了菌体生长。同时NaCl或牛肉膏的添加能够提高发酵液抑菌活性，但添加蛋白胨和同时添加牛肉膏和蛋白胨反而会降低发酵液抑菌活性。这说明蛋白胨会抑制抑菌物质合成。值得一提的是，即使在Landy培养基中添加与NB培养基中相同浓度的各类物质，发酵液的抑菌活性也达不到NB培养基水平。这说明Landy培养基中一些成分会抑制抑菌物质的合成。

a-Landy培养基；b-Landy培养基+10 g/L蛋白胨；c-Landy培养基+10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏；d-Landy培养基+5 g/L牛肉膏；e-Landy培养基+5 g/L NaCl；f-NB培养基

进一步改变NB培养基中NaCl(图3)、牛肉膏(图4)、蛋白胨(图5)、组合氮源(图6)的浓度，以及添加金属离子(图7)和谷氨酸钠(图8)，结果发现，除了在组合氮源实验中发酵液抑菌活性，随着牛肉膏添加量增大而降低外，在其他实验中均呈现，随着添加物浓度增大先上升后下降的趋势，并且在NaCl 5 g/L、牛肉膏15 g/L、蛋白胨 10 g/L、金属离子2 份、谷氨酸钠5 g/L时，达到最大值。多种氮源组合添加时，以同时添加10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏时所得发酵液的抑菌活性最大。对比不同条件下所得发酵液的最大抑菌圈直径可以发现：补充谷氨酸钠和金属离子能够大幅度提高发酵液的抑菌活性，然后依次为牛肉膏单一添加组、NaCl添加组、组合氮源组，而蛋白胨添加组的抑菌活性远低于其他组。说明蛋白胨的添加会抑制抑菌物质的合成。

图3 NB培养基中NaCl含量对发酵液pH、生物量和发酵液抑菌活性的影响

图4 NB培养基中牛肉膏含量对发酵液pH、生物量和发酵液抑菌活性的影响

图5 NB培养基中蛋白胨含量对发酵液pH、生物量和发酵液抑菌活性的影响

进一步分析发现，添加谷氨酸钠和金属离子时，对应于最大抑菌圈时的菌体生物量和发酵结束时的pH值也会较高。从而说明，这些指标之间存在一定的相关性。通过优化组合，可得发酵液抑菌活性最高的培养基组成为：每升培养基中含有葡萄糖20 g，NaCl 5 g，牛肉膏15 g，谷氨酸钠5 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，KCl 1 g，FeSO40.3 mg，MnSO410 mg，CuSO40.32 mg。使用该培养基可使菌体生物量增加90%，60 μL发酵液的抑菌圈直径可达(23.4±0.47) mm，比抑菌效果较好的NB培养基提高了21.9%。

a-10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏；b-10 g/L蛋白胨和10 g/L牛肉膏;c-10 g/L蛋白胨和15 g/L牛肉膏；d-10 g/L蛋白胨和20 g/L牛肉膏；e-10 g/L蛋白胨和25 g/L牛肉膏

图7 NB培养基中离子溶液份数对发酵液pH、生物量和发酵液抑菌活性的影响

图8 NB培养基中谷氨酸钠含量对发酵液pH、生物量和发酵液抑菌活性的影响

2.3 培养基对发酵液中脂肽类抑菌活性物质抗稀释浓度的影响

提取不同培养基条件下的发酵液中脂肽物质，冷冻干燥后，配制成不同浓度，检测其抑菌活性，结果显如表2和图9所示。

从表2可以看出：(1)抑菌圈直径与提取物浓度呈对数正相关。相对而言，低浓度范围内(2.5～5.0 g/L)的增加幅度较大，高浓度范围的增幅较小。这可能与溶液在培养基中扩散范围有限有关。

表2 不同培养基所得脂肽提取物的抑菌活性

图9 不同培养基中脂肽提取物的抑菌效果拟合曲线

(2)不同培养基所得脂肽提取物在相同浓度下的抑菌活性并不相同。这说明培养基组成不仅影响了抑菌物质的产量，而且改变了抑菌物质的种类与比例。相对而言，添加2份离子和5 g/L谷氨酸钠所得活性抑菌物质的含量较高。

(3)菌体在Landy培养基中产生的脂肽提取物总量较少，而且所得产物没有抑菌活性。这与原发酵液有抑菌活性不符。推测菌体在该条件下产生的抑菌物质并非脂肽类物质，而是在脂肽提取条件(pH为2.0)下失去活性的其他物质。

2.4 培养基对抑菌物质种类的影响

HPLC检测结果显示(图10)，贝莱斯芽孢杆菌产生的脂肽物质共有7个峰，其质荷比分别为1 065.79、1 079.91、1 079.96，1 079.95，1 079.92，1 093.98和1 093.98 Da (图11)。分子量相同，但出峰时间不同的几个峰可能是其同分异构体。

峰1，m/z=1 065.79；峰2，m/z=1 079.91；峰3，m/z=1 079.96；峰4，m/z=1 079.95；峰5，m/z=1 079.92；峰6，m/z=1 093.98；峰7，m/z为1 093.98

图11 NB和Landy发酵液中脂肽提取物的物质种类

根据相关研究[5]，m/z=1 065.79 Da 的脂肽可能是 C14 伊枯草菌素 A(Iturin A)的离子加钠([M+Na]+)或C17 表面活性素(surfactin)离子加氢([M+H]+)。m/z=1 079和1 093 Da的物质是1 065 Da 的同系物，可能分别为C15和C16的 Iturin A6 离子加钠([M+Na]+)或者surfactin同系物。

对比不同培养基中脂肽提取物的HPLC图谱可知，Landy培养基所得脂肽物质有7种；除1 079.91和1 079.92外，其他组成含量均低于NB培养基。这可能是导致Landy培养基所得发酵液抑菌活性较低的根本原因。

3 结论

本文研究了培养基组成对贝莱斯芽孢杆菌代谢合成抑真菌活性物质种类和含量的影响，优化得到了抑菌活性物质产量最高的培养基组成。结果表明，适合菌体生长的条件并不适用于活性物质的产生；只有针对抑菌物质的有效合成和活性提高进行条件优化与过程控制，才能有效提高培养物的整体抑菌活性。同时这说明在生产过程中只强调芽孢数量的生产工艺控制并不一定有利于提高产品的整体抑菌活性。本研究所得结果也可为其他芽孢杆菌发酵过程研究提供一定的理论参考和实践依据。