年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中miR-181a和SIRT1的表达关系及意义

孔俐 文燕 刘真 吴平 孙杨 谭德文 张凌

(1重庆爱尔眼科医院，重庆 400000；2重庆市开州区人民医院；3乐山市人民医院)

白内障是由各种原因引起晶状体代谢紊乱导致的晶状体蛋白变性发生的浑浊，中老年人为多发人群〔1〕。miRNAs是一类内源性非编码单链RNA分子，可通过诱导靶基因降解或阻遏其翻译过程而沉默该基因的表达进而参与细胞生长发育、凋亡过程〔2〕。miR-181a属miR-181家族，能通过与多个基因靶向调节，调控细胞的生长与凋亡，有研究表明，在年龄相关性白内障患者晶状体内异常表达〔3〕，沉默信息调节因子(SIRT)1是已被证实的miR-181靶基因之一，可延长细胞寿命，延缓细胞凋亡〔4〕。但关于miR-181a是否调控SIRT1中相关蛋白的表达而参与白内障的发生及发展的研究尚未见报道〔5〕，因此本研究探讨白内障晶状体上皮细胞组织中miR-181a、SIRT1表达水平及二者表达相关性，为临床治疗年龄相关性白内障提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1～9月在重庆爱尔眼科医院诊断为年龄相关性白内障患者62例为白内障组，术中收集晶状体前囊膜标本，置于液氮中保存，其中男28例，女34例；年龄55～75岁，平均年龄(62.13±8.72)岁；平均病程(3.12±1.14)年。另选取同期来医院就诊近视矫正手术42例为对照组，其中男19例，女23例；年龄21～34岁，平均年龄(27.31±6.64)岁；平均病程(3.56±0.82)年。对照组纳入标准：无青光眼、白内障、眼部发炎等眼部疾病；最佳矫正视力≥0.5；晶状体透明。研究组纳入标准：排除其他类型白内障、外伤、青光眼等眼部疾病；最佳矫正视力<0.5；无心脏病、高血压等氧化损伤相关性疾病；裂隙灯下观察晶状体，根据国际晶状体浑浊分级标准〔6〕，晶状体混浊程度达N2或以上。本实验经医院伦理委员会批准，研究对象知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1晶状体上皮细胞前处理 对照组在实施屈光手术中进行前囊膜环形撕囊，直径约为6 mm。生理盐水清洗，置于EP管，-80℃冰箱保存。白内障患者组，进行白内障超声乳化手术，术中前囊膜环形撕囊，直径约为6 mm。生理盐水清洗，置于EP管，-80℃冰箱保存。

1.2.2RT q-PCR法检测晶状体上皮细胞组织中miR-181a和SIRT1 mRNA表达量 取上述液氮保存的晶状体上皮细胞组织，按照Trizol试剂盒说明书操作提取组织总RNA，按照miRNA反转录试剂盒操作步骤将2 μg RNA反转录为cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix试剂说明配反应体系并加样。RT q-PCR反应体系共为20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，双蒸水ddH2O 6.0 μl。完成后将其放入荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95℃ 5 s，95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，共41个循环，72℃终延伸10 min。其中miR-181a以RNU6B为内参基因，SIRT1以β-actin为内参基因，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物设计见表1。反应结束后整理数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法〔7〕计算miR-181a和SIRT1 mRNA的相对表达量。

表1 RT q-PCR引物序列

1.2.3细胞转染 人晶状体上皮细胞系(SRA01/04)，购于中科院细胞系，从液氮罐中取出装有细胞系SRA01/04冻融管，0℃解冻，采用DMEM培养基，包括质量分数为10%的新生牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml 链霉素，37℃、5%CO2的恒温培养箱中，培养24 h。转入离心管，10 000 r/min冷冻离心5 min，弃上清，加入DMEM重悬细胞，37℃培养箱孵育，细胞传代3代后进行细胞接种，以4×105/孔接种到4孔细胞培养板上。分为4组：模拟物阴性对照组、miR-138a模拟物组、抑制物阴性对照组和miR-138a抑制物组，每孔均加入1.5 μl细胞转染脂质体(Lipofectamine RNAiMAX)，此外在4孔内分别加入0.7 μl、浓度为20 μmol/L的模拟物阴性对照物、miR-138模拟物、抑制物阴性对照物、miR-138a抑制物(20 μmol/L)。2 d后用1.2.2中方法检测各组SIRT1表达水平。

1.2.4氧化应激因子水平测定 取晶状体上皮细胞标本3 mm×3 mm，加入pH 7.3的磷酸缓冲液，涡旋震荡，-4℃冷冻离心，酶联免疫吸附试验(ELISA)进行定量检测，检测指标为超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱氨酸(GSH)、谷胱氨酸过氧化物酶(GSH-Px)。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1两组miR-181a和SIRT1 mRNA表达水平 与对照组相比，白内障组miR-181a表达水平显著升高，SIRT1表达水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 两组miR-181a和SIRT1 mRNA表达水平比较

与白内障组比较：1)P<0.05；表3同

2.2晶状体上皮细胞组织中miR-181a和SIRT1表达的相关性 miR-181a和SIRT1呈负相关关系(r=-0.719，P<0.05)。见图1。

图1 晶状体上皮细胞组织中miR-181a和SIRT1表达的相关性

2.3miR-181a调控人晶状体上皮细胞中SIRT1表达 miR-181a模拟物组SIRT1表达水平显著低于模拟物阴性对照组(0.58±0.03 vs 1.01±0.07;t=42.966,P=0.000)；miR-181a抑制物组SIRT1表达水平显著高于抑制物阴性对照组(1.26±0.08 vs 1.02±0.05;t=17.276,P=0.000)。

2.4两组氧化应激水平比较 白内障组SOD、GSH、GSH-Px水平明显低于对照组(P<0.05)，MDA水平明显高于对照组(P<0.05)，见表3。

2.5miR-181a和SIRT1与氧化应激水平相关性 miR-181a表达水平与SOD、GSH、GSH-Px因子呈负相关关系(r=-0.702，-0.739，-0.776)，与MDA水平呈正相关关系(r=0.679)；SIRT1表达水平与SOD、GSH、GSH-Px呈正相关关系(r=0.699，0.743，0.763)，与MDA水平呈负相关关系(r=-0.684)，见图2、图3。

表3 两组氧化应激水平比较

图2 miR-181a表达水平与氧化应激水平相关性

图3 SIRT1表达水平与氧化应激水平相关性

3 讨 论

白内障是晶状体调节功能失常引起的晶状体混浊，视物困难，多发于中老年人，发病率与致盲率均居首位〔8〕。目前手术是治疗白内障的唯一有效手段，取出混浊晶状体核，吸出皮质留下晶状体后囊，术后即刻恢复视力〔9〕。目前白内障的发病机制尚不十分明确，大量试验表明氧化应激损伤是白内障发生的主要危险因素〔10〕，贡献率远高于年龄因素与环境因素〔11〕，已得到学术界认可。正常晶状体存在抗氧化机制递质外界氧化应激反应，通过SOD、GSH、GSH-Px活性对氧化应激产生反应，在此过程中MDA水平下降，随着年龄增加自由基产生过快超过机体清除能力〔12〕，晶状体氧化损伤，致使晶状体浑浊。miR-181a和SIRT1与氧化应激密切相关，马懿等〔13〕研究表明提升SIRT1水平可对抗氧化应激引起的大鼠血管平滑肌细胞衰老；周曦等〔14〕研究结果表明SIRT1在可抑制血管内皮细胞氧化应激损伤中起重要作用；邴森等〔15〕研究表明miR-181a可调控过氧化氢诱导H9c2细胞氧化损伤，在H9c2细胞氧化损伤过程中起关键作用。

SIRTA是辅酶Ⅰ依赖的去乙酰化酶，通过去乙酰化组蛋白与非组蛋白，在细胞的生存凋亡中发挥重要作用，可延长细胞寿命，延缓细胞凋亡，正常晶状体内存在抗氧化系统可防御外界氧化应激损伤，随着年龄增加，晶状体抗氧化系统逐渐退化，引起白内障等眼部疾病发生。Jaliffa等〔16〕在成年鼠眼角膜晶状体均发现SIRT1表达，主要定位于晶状体上皮细胞的细胞核与细胞质，郑天玉〔17〕在人晶状体上皮细胞SIRT1表达研究中发现白内障患者晶状体上皮细胞SIRT1明显低表达。本研究结果说明白内障患者晶状体上皮细胞中SIRT1表达水平明显上调，揭示其与白内障的发生及发展密切相关。miR-181a属miR-181家族，能通过与多个基因靶向调节，调控细胞的的生长与凋亡。本研究结果提示白内障患者晶状体上皮细胞中miR-181a表达水平明显上调，其与白内障的发生及发展密切相关；miR-181a的过表达影响SIRT1的表达，miR-181a可能在白内障患者的迁移过程中发挥重要作用，可通过上调表达而增强细胞凋亡进而对患者病情产生不利影响。本研究结果证实miR-181a高表达和SIRT1低表达与氧化应激系统受损密切相关，与陈星等〔18〕结果类似。

综上所述，miR-181a在白内障晶状体上皮细胞中高表达，SIRT1呈低表达，二者呈负相关关系，miR-181a可调控SIRT1表达，miR-181a高表达和SIRT1低表达与氧化应激系统受损密切相关。由于样本量不足及时间因素，本研究存在一定不足之处，关于miR-181a与SIRT1在白内障发生过程中的具体分子机制有待进一步研究。