AECOPD患者外周血单个核细胞NOD2和NLRP3表达变化及其临床意义

纪荣祖，常璠，刘春燕

西宁市第三人民医院，西宁810005

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一组气流受限为特征的肺部疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，主要表现为肺功能加速下降[1]。流行病学调查显示，我国40岁以上人群COPD的患病率为8.2%[2]。COPD急性加重期(AECOPD)通常指在疾病过程中，患者短期内咳嗽、咳痰、气短和(或)喘息急性加重，痰量增多，呈脓性或黏脓性。临床研究证实，AECOPD能够导致肺功能迅速下降甚至丧失，可严重影响患者生活质量，预后较差[3]。迄今为止，AECOPD的发病机制尚不完全清楚，可能与免疫功能失调和炎症反应等有关[4]。核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLRs)是固有免疫系统的组成部分，能通过特异性识别病原相关分子模式来激活先天免疫系统，从而抵抗病原体入侵[5]。核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)是在N末端有2个半胱天冬酶补充结构域的NLRs家族成员，能够增强自我吞噬功能，在宿主免疫防御中具有重要作用。研究报道，NOD2能够通过激活核因子κB(NF-κB)参与调控免疫反应中的炎症反应[6]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)属于NOD家族成员，是由NLRP3效应蛋白Caspase-1及凋亡相关点样蛋白构成的复合体。NLRP3活化与炎症性自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。已有研究证实，NOD2、NLRP3能够参与炎症性肠病等炎症性疾病的发病过程[7,8]。但目前关于NOD2、NLRP3与AECOPD关系的报道较少。为此，本研究观察了AECOPD患者外周血单个核细胞NOD2、NLRP3表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月～2019年1月西宁市第三人民医院收治的AECOPD患者123例(AECOPD组)。纳入标准：①符合《慢性阻塞性肺疾病诊断、处理和预防全球策略(2011年修订版)》[9]，具有典型的AECOPD临床表现，并经肺功能检查、动脉血气分析等确诊；②发病至入院时间<24 h；③年龄≥18岁。排除标准：①合并恶性肿瘤及心、肝、肾等重要脏器严重功能不全者；②合并自身免疫性疾病、急慢性感染性疾病者；③合并其他可能影响本研究结果的肺部疾病，如肺纤维化、支气管哮喘、肺结核等；④近期有重大外伤史或手术史者；⑤入院前接受过糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂等治疗者；⑥有肺功能检查禁忌证者；⑦妊娠期或哺乳期女性。其中，男73例、女50例，年龄34～79(57.95±11.26)岁，BMI 21～29(23.49±1.53)kg/m2；病程3～14(7.34±2.05)年。同期随机选择正在该院随访的COPD稳定期(SCOPD)患者60例(SCOPD组)，其诊断符合《慢性阻塞性肺疾病诊断、处理和预防全球策略(2011年修订版)》[9]，COPD病情稳定≥12周且无明确感染。其中，男33例、女27例，年龄38～75(58.61±12.03)岁，BMI 20～29(23.08±1.79)kg/m2，病程2～11(6.59±2.83)年。同期随机选择在西宁市第三人民医院体检健康的志愿者60例(对照组)，男38例、女22例，年龄34～77(56.29±12.56)岁，BMI 21～28(23.23±1.64)kg/m2。三组性别、年龄、BMI具有可比性。本研究经西宁市第三人民医院医学伦理委员会批准，所有研究对象或其家属知情同意。

1.2 外周血单个核细胞NOD2、NLRP3表达检测 AECOPD组于入院次日，SCOPD组和对照组于入院当日，采集清晨空腹肘静脉血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，3 000 r/min离心10 min，留取上层血清，-80 ℃冰箱保存。取血清1 mL置于含1 mL PBS的离心管中，充分混匀后转移至15 mL离心管，然后加入人淋巴细胞分离液2 mL，2 000 r/min离心15 min，吸取单个核细胞层置于1.5 mL不含酶的EP管中，再加入适量PBS充分混匀，3 000 r/min离心10 min，洗涤2次后保留沉淀备用。向沉淀中加入TRIzol 1 mL，反复吹打后室温静置5 min，于-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。按逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按PCR扩增试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：NOD2上游引物5′-CACCCTGACCGTGTCCTGT-3′，下游引物5′-CACCTTGCGG GCATTCTT-3′，扩增片段长度159 bp；NLRP3上游引物5′-CTTCCTTTCCAGTTTGCTGC-3′，下游引物5′-TCTCGCAGTCCACTTCCTTT-3′，扩片段长度212 bp；GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，扩增片段长度197 bp。PCR反应体系共20 μL：SYBR Green Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.3 μL，ROX Reference Dyell 0.4 μL，cDNA模板 2 μL，灭菌蒸馏水7 μL；反应条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 60 s、72 ℃ 40 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 外周血炎症细胞因子检测 AECOPD组于入院次日，SCOPD组和对照组于入院当日，采集清晨空腹肘静脉血4 mL，3 000 r/min离心10 min，留取上层血清，-80 ℃冰箱保存。采用Elx 800酶标仪、ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α，试剂盒由深圳欣博盛生物科技有限公司提供。所有操作严格按照试剂盒说明进行。

1.4 肺功能检测 所有研究对象采血同日，采用CHESTAC-8900肺功能仪检测第1秒用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FVC)，计算FEV1/FVC。

2 结果

2.1 各组外周血单个核细胞NOD2、NLRP3 mRNA表达比较 见表1。

表1 各组外周血单个核细胞NOD2、NLRP3 mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与SCOPD组比较，#P<0.05。

2.2 各组血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平比较 见表2。

表2 各组血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与SCOPD组比较，#P<0.05。

2.3 各组FEV1、FVC、FEV1/FVC比较 见表3。

表3 各组FEV1、FVC、FEV1/FVC比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与SCOPD组比较，#P<0.05。

2.4 AECOPD患者外周血单个核细胞NOD2、NLRP3 mRNA表达与血清炎症细胞因子、肺功能相关指标的关系 Pearson积矩相关分析显示，AECOPD患者外周血单个核细胞NOD2 mRNA表达与血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平均呈正相关关系(r分别为0.682、0.634、0.701、0.653、0.669，P均<0.05)，与FEV1、FVC、FEV1/FVC均呈负相关关系(r分别为-0.722、-0.734、-0.759，P均<0.05)；外周血单个核细胞NLRP3 mRNA表达与血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α均呈正相关关系(r分别为0.716、0.672、0.734、0.685、0.671，P均<0.05)，与FEV1、FVC、FEV1/FVC均呈负相关关系(r分别为-0.768、-0.725、-0.776，P均<0.05)。

2.5 外周血单个核细胞NOD2、NLRP3诊断AECOPD的效能分析 绘制外周血单个核细胞NOD2、NLRP3诊断AECOPD的ROC曲线，结果显示，外周血单个核细胞NOD2诊断AECOPD的曲线下面积(AUC)为0.794(95%CI：0.696～0.891)，最佳截断值为0.34，此时其诊断AECOPD的敏感性为83%、特异性为79%、准确性为81%；外周血单个核细胞NLRP3诊断AECOPD的AUC为0.823(95%CI：0.727～0.918)，最佳截断值为4.97，此时其诊断AECOPD的敏感性为86%、特异性为81%、准确性为85%；外周血单个核细胞NOD2联合NLRP3诊断AECOPD的AUC为0.914(95%CI：0.856～0.973)，其诊断AECOPD的敏感性为93%、特异性为87%、准确性为90%。

3 讨论

近年来，随着人口老龄化加剧及环境污染加重，COPD的发病率逐年升高，已成为一个重要的公共卫生问题。烟雾、病原微生物、有害气体等诱因能够使COPD病情急性进行性加重，继而进展至AECOPD，患者再住院率和病死率较高，预后较差[10]。因此，寻找敏感性高、特异性强的分子生物标志物辅助临床早期诊断AECOPD，对缓解病情和改善预后具有重要意义。

迄今为止，AECOPD的发病机制尚不完全清楚。有研究表明，固有免疫和炎症反应是AECOPD发病的关键环节[11]。病原体的模式识别受体与病原体相关分子模式通过相互作用使下游信号通路激活，刺激淋巴细胞、中性粒细胞等合成并释放大量炎症细胞因子，导致固有免疫和炎症反应，而机体能够通过固有免疫有效清除外源性有害物质和病原体等[12]。病原体模式识别受体有NLRs家族、TLRs家族等。NOD2为广泛存在于人体内的NOD蛋白家族成员，在遗传上具有高度保守性，在免疫和炎症反应过程中能够发挥重要的调控作用[13]。NOD2在识别病原菌细胞外壁上的脂多糖和肽聚糖后，在蛋白激酶的作用下结合特异性配体，激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶信号通路，介导凋亡基因的转录调控，活化效应性Caspase-3，引起细胞核内DNA链断裂，导致细胞结构解体而死亡，最终清除病原体[14]。有研究还发现，NOD2激活NF-κB信号通路还可促使NOD2 mRNA过表达，继而促进炎症细胞因子大量释放[15]。Pranculiene等[16]研究发现，NOD2在炎症性肠病肠黏膜组织中表达上调，并可能通过介导炎症反应参与疾病过程。NLRP3属于NLRs家族的炎症小体，主要由3部分构成，分别为NOD样受体、凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1前体，在树突状细胞、中性粒细胞等内源性免疫细胞中广泛存在[17]。正常生理情况下，NLRP3呈自身抑制状态，当内源性或外源性信号刺激NLRs使其发生活化并诱导自身寡聚化，可迅速募集凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1前体蛋白，三者聚集并装配形成炎症小体，参与调控炎症细胞因子分泌，如IL-1β、IL-18等，进而介导炎症反应[18]。Cocco等[19]报道，NLRP3在炎症性肠病的发生、发展过程中具有重要作用。赵紫琴等[20]研究表明，类风湿性关节炎患者滑膜组织NLRP3表达上调，且其表达变化与疾病活动度密切相关，可作为类风湿性关节炎一个潜在的治疗靶点。但目前关于NOD2、NLRP3与AECOPD关系的报道较少。

本研究结果发现，AECOPD组和SCOPD组外周血单个核细胞NOD2、NLRP3表达均明显高于对照组，且AECOPD组明显高于SCOPD组。结果提示，NOD2、NLRP3能够参与COPD的发病过程，且随着病情加重，二者表达逐渐升高。在环境因素中，病原体感染是导致COPD发病的重要因素。固有免疫是机体对抗病原体入侵的第一道防线，即NOD2通过激活NF-κB信号通路促进炎症细胞分泌并释放大量促炎因子，导致机体固有免疫激活并引起炎症反应。因此，COPD病情越重，固有免疫反应越明显，NOD2表达越高[21]。NLRP3介导COPD发病过程可能是因为其发挥了关键调节和转录因子的作用。当病原体入侵时，NOD样受体识别不同病原体分子模式后激活Caspase-1而促进炎症因子释放，诱导放大炎症反应，激活固有免疫，进而介导COPD气道损伤和炎症反应过程[22]。IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α是参与炎症反应的重要细胞因子。这些炎症细胞因子能够通过介导气道炎症反应参与COPD的发生、发展。本研究结果发现，AECOPD组和SCOPD组血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平均高于对照组，且AECOPD组明显高于SCOPD组，进一步证实IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α等炎症细胞因子能够参与COPD的发生、发展。

肺功能是评估COPD病情程度的客观指标，也是临床制定治疗方案的参考依据之一。本研究结果显示，AECOPD组和SCOPD组FEV1、FVC、FEV1/FVC较对照组均明显降低，且AECOPD组明显低于SCOPD组，表明COPD病情越严重，患者肺功能越差。Pearson积矩相关分析发现，AECOPD患者外周血单个核细胞NOD2、NLRP3 mRNA表达与血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平均呈正相关关系，提示NOD2、NLRP3可能通过其促炎作用参与COPD的发生、发展。本研究还发现，AECOPD患者外周血单个核细胞NOD2、NLRP3 mRNA表达与FEV1、FVC、FEV1/FVC均呈负相关关系，提示NOD2、NLRP3可作为临床辅助评估COPD病情程度的重要指标。通过绘制ROC曲线评估外周血单个核细胞NOD2、NLRP3诊断AECOPD的效能发现，二者单独检测对AECOPD的诊断均具有一定价值，但二者联合检测的诊断价值更高。因此，早期联合检测外周血单个核细胞NOD2、NLRP3可辅助诊断AECOPD。

综上所述，AECOPD患者外周血单个核细胞NOD2、NLRP3表达上调，其表达上调能通过调控炎症反应而促进COPD的发生、发展。早期联合检测外周血单个核细胞NOD2、NLRP3可辅助诊断AECOPD。