SD大鼠中缝背核脑立体定位的最佳参数研究＊

郭海波，全 睿，王 慧

中缝核位于大脑中缝附近的狭窄区域内，可分成数个核团，总称为中缝核群。其特点是产生单胺类神经递质 5-羟色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT），中缝背核（dorsal raphe nucleus，DRN）是中缝核群内5-HT含量最多的核团，而5-HT的合成、储存和释放与多种生理功能有关，如：睡眠、体温、心血管、情绪和精神活动、下丘脑内分泌、痛觉和镇痛等［3］。故利用向DRN微量注射药物的方法来研究与中缝核或5-HT相关的神经机制的动物实验越来越受到学者的青睐。而大鼠作为最常用的实验动物，对其脑部DRN微量注射实验的成功与否，参数的定位准确是关键。而利用脑立体定位图谱快速定位核团是开展实验的前提。对于不同品系的大鼠，图谱的选择有所不同。Paxinos＆Watson大鼠脑立体定位图谱是科研当中使用最广、影响最大的图谱，它是以Wistar大鼠作为标本制定。而国内课题组最常用的实验动物是Sprague-Dawley（SD）大鼠；SD大鼠最初来源于Wistar大鼠［4］，但仍不同于Wistar大鼠，Wistar大鼠头部较宽、耳朵较长；而SD大鼠头部狭长［5］；正是有如此差异，所以在脑立体定位图谱的选择上，特别是在脑部核团精准定位上有着不可忽视的差别。基于此，该课题组对10只SD大鼠的DRN进行了位置探索，参照两本脑立体定位图谱，根据定位后的切片染色结果，对DRN的立体定位参数进行了研究，实践了定位技术的各个环节，提高了定位准确性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年清洁级SD雄性大鼠10 只，体重（250±20）g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，许可证号 NO.SCXK（渝）2007-0008。实验条件符合贵州中医药大学动物健康、福利和处死等相关要求。

1.1.2 主要试剂 4%多聚甲醛溶液、HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器和设备 手持式90型颅骨钻（韩国SAESHIN公司），注药导管（长10 mm，外径0.64 mm，内径0.45 mm）、CMA120脑立体定位仪 （深圳瑞沃德科技公司），冷冻切片机 （德国Leica CM1950冷冻切片机），BX53生物显微镜（日本Olympus）。

1.2 方 法

1.2.1 颅脑固定 大鼠称重后按3.5 mg/100 g给予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，头顶部备皮，将大鼠门齿固定在齿板上，耳杆插入两侧外耳道，调节两侧耳杆至距离相等，略微调整齿板高度使颅脑被固定于水平位。碘酊和乙醇依次消毒，于颅骨顶部纵向切开皮肤，切口长约2.0 cm，剥离骨膜，暴露前囟、人字缝，对钻孔位置进行标记。

1.2.2 核团定位 （1）几个定位概念。根据图谱确定核团相对于Bregma（前囟）的坐标值，AP（Anterior-Posterior）值：前囟前后，立体定位仪Y轴；ML（Medial-Lateral）值：中逢内外，立体定位仪 X轴；DV（Dorsal-Ventral）值：硬脑膜下，立体定位仪 Z轴。进针时一般还会用到R/L（Right-Left）值：中缝左右，和 H（High）值：进针深度。 （2）根据 Paxinos＆Watson大鼠脑立体定位图谱，中缝核的位置冠状面看从AP-6.84 mm开始显示，持续到AP-8.04 mm，之后缩小，直至中缝背核尾侧部逐渐消失。在AP-7.32 mm处中缝核上下径在5.6～7.2 mm，此处为图谱所示中缝背核直径最宽的位置，认为是最佳进针位置，选择 AP-7.6 mm、R/L 0.0 mm、H 6.5 mm 为进针位置。（3）根据包新民教授编著的大鼠脑立体定位图谱，中缝核的位置冠状面看从前囟-6.4 mm开始显现，至-7.4 mm达到左右直径最宽，此后中缝核开始逐渐缩小，到-9.0 mm在冠状面消失。由图谱切面看在前囟-7.4 mm处上下径为 5.1～6.4 mm，为DRN的最佳进针位置，选择AP-7.4 mm、R/L 0.0 mm、H 6.2 mm为进针位置。

1.2.3 埋置注药导管 对大鼠颅骨顶部进行标记，使用颅骨钻在颅骨上开窗直径1 mm、深度0.5 mm的圆洞，用细针头挑破硬脑膜，以避免硬脑膜对微量注射导管产生阻碍。在脑立体定位仪标尺上确定立体参数，以保证置入的准确性。将导管进入到所需位置后，外用牙科水泥固定，待水泥干硬后，解除脑立体定位仪固定杆。所有大鼠手术完毕后腹腔注射青霉素钠40万U，连续3 d，单笼喂养，1 W后灌注取脑。

1.2.4 取脑及组织固定 将大鼠麻醉后，仰卧，四肢固定于鼠板上，下垫冰袋，提起腹部皮肤，在剑突下打开腹腔，暴露肌层，沿两侧肋弓剪开胸腔，用止血钳夹持剑突上翻，暴露胸腔；剪断心脏周围结缔组织，游离心脏，充分暴露心脏及升主动脉［6］，从左心室底部插入灌流针，深入到主动脉根部，用动脉夹固定针体，剪开右心耳放血。快速灌流生理盐水200 ml，待右心耳流出液呈透明状，换用4%多聚甲醛100 ml继续灌流，可见大鼠四肢伸展抽搐、尾巴僵硬、全身强直，灌流直至多聚甲醛完毕。将大鼠俯卧固定，剪开头部皮肤，断头剥离颅骨，取出大脑。切忌动作粗暴，勿使金属导管损伤脑组织［6］。取出脑组织迅速置于4%多聚甲醛的标本瓶中，4℃固定沉底后转移到30%蔗糖溶液脱水。

1.2.5 冷冻切片及染色 脑组织脱水后取出，采用冰冻切片，进行快速苏木素-伊红染色［7］，中性树胶封固后显微镜下观察。

2 结果

经过比对，笔者认为两本脑立体定位图谱在SD大鼠DRN的定位上存在着差异。按照Paxinos＆Watson大鼠脑立体定位图谱，选择AP-7.6 mm、R/L 0.0 mm、H 6.5 mm定位参数，发现进针部位较深，达到了DRN腹侧部，接近中缝核下端（图1A）。以包新民编著的大鼠脑立体定位图谱为依据，选择AP-7.4 mm、R/L 0.0 mm、H 6.2 mm 为定位参数，发现进针部位在DRN，深度在DRN背部和腹侧部之间，位置较为合适（图1B）。

图1 大鼠脑组织切片染色

3 讨论

脑科学是生命科学中最为活跃和最有发展前景的科学。脑科学的研究离不开实验动物，而大鼠由于大小合适、繁殖力强、经济实惠是神经科学研究中最常用的实验动物。明确大鼠中缝背核立体定位参数在中缝核或5-HT相关的微量注射研究中至关重要，决定着实验结果的准确性。依据脑立体定位图谱快速确定核团位置是实验开展的前提。当前应用最广的是Paxinos＆Watson大鼠脑立体定位图谱，其是以Wistar大鼠为标本制作，在实验中以其他品系大鼠作为实验动物时，立体定位的参数的确定会有一定差异。SD大鼠作为神经科学中应用最为广泛的实验大鼠之一，明确其中缝背核立体定位参数，在科学研究中有着积极意义。搜索相关文献可知［8-10］，国内课题组使用的多数为SD大鼠，利用Paxinos＆Watson脑立体定位图谱，在确定DNS定位参数时，有的直接参考既往文献，有的求取校正系数，如有学者［8］使用SD雄性大鼠，依据Paxinos＆Watson脑立体定位图谱，先是测量出大鼠实际前后自间距M，求取校正系数K=M/9.0，根据K值再求取实际坐标 X'（矢状缝旁）=X×K，Y'（前囟后）=Y×K，Z'（水平面下）=Z×K，以此来获得中缝核的立体定位参数。

综上所述，对大鼠脑组织的神经核团进行准确的立体定位是开展相关研究的前提，大鼠大脑因品系的不同以及月龄的大小而有所差别，目前尚未看到有研究不同品系以及不同月龄大鼠大脑部核团定位的相关文献，故探讨和实践不同品系大鼠的脑部核团的定位参数具有积极意义。要达到对大鼠脑部核团的准确定位，必须熟悉大鼠脑部的组织结构，娴熟的掌握和准确的运用脑立体定位仪，恰当地选择合适的脑立体定位图谱，才能获得准确的核团立体定位参数。