药物性肝损伤伴自身免疫现象患者血清γ干扰素诱导蛋白10水平及其单核苷酸多态性

任 姗， 杜晓菲， 黄云丽， 黄春洋， 张晓丹， 单 晶， 陈新月

首都医科大学附属北京佑安医院 肝病免疫科， 北京 100069

由于药物、保健品的频繁使用及环境毒物等多种因素的影响，药物性肝损伤(DILI)发病率呈逐年上升趋势，部分患者病情反复，起病即出现重症化趋势，是近年来急性肝衰竭的主要原因之一[1]。越来越多数据证实DILI与人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ、Ⅱ类基因遗传多态性相关，表明适应性免疫在DILI中发挥重要作用[2-6]。γ干扰素诱导蛋白-10(interferon γ-induced protein 10,IP-10)作为趋化因子(CXC)家族中一员，与其受体CXCR3相互作用，趋化及激活T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞，发挥抗感染、抑制病毒等多种生物学功能。近年来有研究[7-8]显示IP-10参与了狼疮肾炎、自身免疫性肝炎等多种自身免疫性疾病进展，但在DILI中的表达少有研究。本研究通过检测血清IP-10水平及其基因多态性，探讨IP-10联合宿主单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)对DILI伴自身免疫现象的鉴别意义，旨在为DILI的诊断、预防及治疗提供新的依据和思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2016年10月至2019年6月于本院肝病免疫科诊治的DILI患者168例作为研究对象，DILI诊断标准采用2015年中华医学会肝病学分会《药物性肝损伤诊治指南》[9]推荐的RUCAM 量表：超过8分为高度可能；6～8分为可能性大；3～5分为可能；1～2分为不太可能，等于或小于0分除外诊断；本研究纳入评分≥6分的患者。排除标准：(1)合并病毒性肝炎(包括HAV、HBV、HCV、HEV、巨细胞病毒、EB病毒)和HIV等感染；(2)合并自身免疫性、遗传代谢性、脂肪性或酒精性肝病；(3)合并恶性肿瘤；(4)静脉药瘾者；(5)合并风湿性疾病、内分泌及代谢性疾病；(6)4周内使用过糖皮质激素或其他免疫抑制剂者。本研究方案得到首都医科大学附属北京佑安医院医学伦理委员会批准(批号：LL-2018-131-K)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 临床资料采集及标本收集 收集患者临床资料，包括一般情况、合并用药、主要症状和体征、实验室检查、治疗方案、临床转归等。所有入组患者均于治疗基线留取全血、血清，于-80 ℃保存以备检测SNP及IP-10水平。

1.3 病例分组 DILI伴自身免疫现象组，即AI-DILI组，依据自身免疫性肝炎(AIH)简化诊断标准[10-12]，选取分数4～6分的患者[包括抗核抗体(ANA)/抗平滑肌抗体(SMA)/抗肝肾微粒体抗体(抗LKM)-1阳性或IgG升高或病理提示界面炎]；非AI-DILI组为分数<4分。

AIH简化诊断标准参考国际自身免疫性肝炎小组( IAIHG) 2008年AIH 简化积分系统：自身抗体、血清 IgG 水平、肝脏组织学变和排除病毒性肝炎四个项目进行评分，每个项目最高计2分，共计8分：6～7分为“可能”的AIH，>7分可确诊AIH。

1.4 检测方法

1.4.1 实验室检测 血清生化学指标： ALT、AST、ALP、TBil、DBil、GGT、Alb、总蛋白(TP)采用OLMPUS-AU5400生化检测仪；免疫学指标：血清IgG 和IgM采用美国 Beckman coulter Array 360 全自动特种蛋白分析仪检测。自身免疫性肝病相关抗体:ANA、SMA、抗LKM、抗线粒体抗体(AMA)、抗可溶性肝抗原抗体/抗肝-胰抗体(SLA/LP)、抗SP100和抗gp210采用ELISA及免疫印迹法(试剂购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司)。

1.4.2 IP-10及SNP检测 血清IP-10水平检测：采用液相芯片技术(Luminex技术)，Bio-Plex 200 system(美国Bio-Rad公司)。IP-10(rs56061981位点)SNP分型：TaqMan探针基因分型，上海基康公司检测(罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR仪，LCS480 1.5.1.62软件进行基因分型)。

1.4.3 超声引导下肝穿刺活组织检查 超声引导下肝穿刺活组织检查患者102例：B 超引导下MAGNUM活检系统(Bard Peripheral Vascular, Inc, 美国)经皮穿刺取肝组织，穿刺肝组织长度>1.0 cm；10%中性福尔马林液固定标本及石蜡包埋。4 μm 连续切片，分别做HE、Masso三色、Gomori网织纤维和D-PAS染色。

2 结果

2.1 一般资料 168例DILI患者中男56例，女112例；年龄19～70岁，平均(47.3±12.5)岁。其中AI-DILI组72例，男22例，女50例；年龄19～69岁，平均(48.0±12.0)岁。非AI-DILI组96例，男34 例，女62例；年龄22～70 岁，平均(50.6±11.2)岁，两组患者在年龄、性别构成比上差异均无统计学意义(P值均>0.05)。用药情况分析：患者中应用中草药/中成药及膳食补充剂74例(44.05%)，其中应用较多的有治疗皮肤病、骨科疾病药物及染发剂、膳食补充剂。应用解热镇痛药28例(16.67%)，抗微生物药21例(12.50%)，降脂药16例(9.52%)，调节血糖药11例(6.55%)，抗肿瘤药(化疗药及靶向药)8例(4.76%)，广谱抗病毒药6例(3.57%)，抗癫痫药4例(2.38%)。

2.2 AI-DILI组与非AI-DILI组临床指标比较 两组间AST及IgG水平差异均存在统计学意义(P值均<0.05)(表1)。在自身抗体检测方面：AI-DILI组自身抗体阳性有66例(91.67%)，依据发生比例的高低分别是ANA、SMA、ACA、SSA/SSB、细胞骨架抗体、APCA。非AI-DILI组合并自身抗体阳性12例(12.5%)，两组之间合并自身抗体阳性的比例存在显著差异 (χ2=103.8，P<0.05)。168例患者中有64例(AI-DILI组38例，非AI-DILI组26例)为重度肝损伤[TBil≥5×ULN(85.5 μmol/L)，伴或不伴 INR≥ 1.5]，其余均为轻度及中度肝损伤，均予以保肝支持治疗。重度肝损伤患者应用甲强龙的剂量为(0.65± 0.15)mg·kg-1·d-1，属于中小剂量，激素应用后首次调整剂量时间(减量或停用)为(8.0±4.1)d，其中直接停用28例，逐渐减量36例[应用时间<1月(短疗程)21例，3月内(中疗程)15例]。所有患者随访时间为3～17个月，62例(36.9%)患者出现病情反复(ALT或TBil波动)，但其AIH 简易评分均未达到 AIH 的诊断标准。

表1 AI-DILI组与非AI-DILI组血清生化学指标及免疫指标

2.3 IP-10基因多态性(rs56061981)与DILI临床转归的相关性 IP-10基因rs56061981位点基因型频率与人种关系并不显著(依据NCBI官方SNP数据)：C等位基因在非洲人群比例略低，其余如亚洲人群或欧洲人群比例较高(86.38% vs 93.33%,P=0.07)。本研究显示，CC基因型在DILI患者中的分布频率与一般人群[13]相当(69.05% vs 78.89%，P=0.43),而且携带C等位基因也在二者间大致相同(78.57% vs 88.98%，P=0.25)(表2)。这提示IP-10基因多态性似乎并不能影响DILI的易感性以及人群的分布差异性。

AI-DILI组的患者CC基因型频率显著高于非AI-DILI组(χ2=4.592，P=0.03)，同时AI-DILI组携带C等位基因频率显著高于非AI-DILI组(χ2=4.41，P=0.04)(表2)。

2.4 DILI治疗过程中血清IP-10表达的变化 AI-DILI患者基线IP-10水平显著高于非AI-DILI患者[(627.99±198.07] pg/ml vs (378.13±218.45) pg/ml，t=7.34,P<0.05](图1a)，且与基线AST水平及AIH评分呈正相关(r值分别为0.67、0.79，P值均<0.05)。

随着治疗进展，所有患者2周时IP-10水平逐渐下降，4周时IP-10水平显著下降，12周及治疗结束时IP-10水平相接近，整体的变化趋势差异有统计学意义(F=6.305，P<0.05)(图1b)；分组分析显示其变化趋势在AI-DILI组更为明显(F=9.42，P<0.05)，与基线比较治疗2周时AI-DILI组水平显著下降[(627.99±198.07) pg/ml vs (423.14±221.65) pg/ml，t=7.62，P=0.04)，继续治疗至4周IP-10水平降至(311.23±171.90)pg/ml，12周及治疗结束时分别为(230.73 ±128.26)pg/ml和(208.33±68.95)pg/ml(图1c)；非AI-DILI组的变化趋势无显著差异(F=1.07，P=0.23)(图1d)。

表2 IP-10 rs56061981基因型及等位基因在不同组间的分布频率

注：a，2组患者IP-10水平比较；b，所有患者IP-10变化；

2.5 基线血清IP-10的水平预测AI-DILI 基于ROC曲线进一步分析基线IP-10水平对DILI伴自免现象的预测作用，结果显示，基线IP-10预测AI-DILI的ROC曲线下面积为0.832，敏感度、特异度分别为0.846、0.867，最佳阈值为527.03 pg/ml(图2)。

2.6 血清IP-10水平联合IP-10基因多态性预测AI-DILIIP-10 rs56061981位点CC基因型在AI-DILI组分布频率显著高于非AI-DILI组，故进一步分析IP-10 CC基因型及血清IP-10变化联合预测DILI伴自身免疫现象。在IP-10 CC基因型的116例患者中，基线IP-10水平<527.03 pg/ml的患者有51例(43.97%)，≥527.03 pg/ml的患者65例(56.03%)，而在52例CT/TT基因型患者中，<527.03 pg/ml的患者有32例(61.54%)，≥527.03 pg/ml的患者20例(38.46%)，差异有统计学意义(χ2=7.89，P=0.03)(图3a)。而且，CC基因型患者中基线IP-10水平≥527.03 pg/ml的有80%(52/65)为AI-DILI，基线IP-10水平<527.03 pg/ml的患者有7.8%(4/51)为AI-DILI；而在CT/TT基因型患者中基线IP-10水平≥527.03 pg/ml的患者仅有50%(10/20)为AI-DILI，基线IP-10水平<527.03 pg/ml的有31.25%(6/32)为AI-DILI，差异均有统计学意义(χ2值分别为13.28、59.80，P值分别为0.006、<0.01)(图3b)。联合CC基因型及基线IP-10≥527.03 pg/ml，预测AI-DILI发生的阳性预测值为92.84%，阴性预测值为86.33%。

图3 IP-10基因多态性(rs56061981)结合基线IP-10水平

3 讨论

2010年Russmann等[14]研究显示，宿主遗传易感背景以及适应性免疫在DILI的发病机制中发挥了重要作用，提示炎性细胞因子的释放及相互作用贯穿于整个DILI发生、发展的全过程，在免疫应答中发挥了关键作用，主要包括IL、干扰素及趋化因子等。而IP-10作为CXC趋化因子家族中重要的炎症因子，能够特异性活化表达CXCR3的相关细胞，诱导细胞毒性T淋巴细胞的活化，并与干扰素相互协同，在各种肝脏疾病中发挥促炎作用，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎以及刀豆蛋白A诱导的DILI[15]。而宿主基因多态性现象，尤其是基因启动子区的SNP可以影响细胞因子的表达，从而使宿主对抗原免疫反应的强度存在一定差异。通过细胞因子发挥免疫效能是宿主免疫系统执行效应的主要方式，故选择宿主目的基因时，宿主基因多态性的不同需要进一步结合其下游抗病毒蛋白或者细胞因子表达差异进行综合分析[16-18]。

首先，本研究显示IP-10 SNP的确会影响IP-10血清水平表达差异：IP-10基因rs56061981位点CC基因型患者其基线IP-10表达显著高于非CC基因型，这与最近研究[19-20]结果一致，IP-10启动子区rs56061981位点的突变改变了核内蛋白的亲和力进而调节IP-10的表达，将增强IP-10的转录和肝脏炎症反应，使男性慢性乙型肝炎患者干扰素治疗效果提高，出现HBeAg及HBsAg滴度下降，将是一个新的潜在性的SNP位点。其次，本研究显示IP-10基因rs56061981位点CC基因型在AI-DILI组的分布频率显著高于非AI-DILI组。第三，本研究也显示AI-DILI组患者IP-10水平显著高于非AI-DILI组，随着治疗的进行，DILI患者血清IP-10水平总的变化趋势为：2周时IP-10水平开始下降，4周时明显低于基线水平，12周及治疗结束时IP-10水平相接近；进一步依据分组分析显示，该变化趋势在AI-DILI组更为显著，而非AI-DILI组各治疗时间点IP-10变化不具备统计学差异。

基于上述相关性，将宿主IP-10基因多态性结合其细胞因子表达水平共同来预测DILI伴自身免疫现象的发生。CC基因型患者中基线IP-10水平≥527.03 pg/ml有80%(52/65)为AI-DILI，CC基因型联合基线IP-10≥527.03 pg/ml预测AI-DILI的效能显著提高。迄今为止，IP-10 SNP是否确定影响血清IP-10水平的表达，二者是否与AI-DILI易感性有关鲜有报道，本研究显示这二者与AI-DILI的发生密切相关。Xie等[21]研究也提示IP-10血清表达水平与DILI的严重程度显著相关，并依据该指标建立模型对DILI严重程度进行预测。另外，也有研究[22]显示，IP-10还可用于预测急性HIV感染时CD4+T淋巴细胞下降趋势以及疾病的进展，而IP-10 rs56061981位点可作为潜在保护性SNP位点预测肺结核患者疾病严重程度，联合IP-10 水平其预测价值更为显著[23]。

当AI-DILI与AIH鉴别诊断存在困难时,可使用糖皮质激素,观察对激素的应答效果,前者应答更快,需要的剂量也较小,最为重要的是停用糖皮质激素不会出现病情的反复,而后者停用激素会出现病情反复。故在临床表现及病理学上鉴别诊断存在困难时，治疗后随访是鉴别的重要手段。本研究随访时间为3～17个月，但还需要长期随访进行验证。

综上所述，本研究证实了IP-10在鉴别诊断DILI伴自身免疫现象的临床意义，同时IP-10基因多态性将影响血清IP-10水平的表达，二者联合预测AI-DILI的效能显著提高。除了联合宿主基因多态性及其下游编码的蛋白表达水平共同预测以外，笔者将在之后的AI-DILI发病机制研究中论证作为效应细胞因子，IP-10联合干扰素γ影响CD4+辅助性T淋巴细胞1的功能。