病程相关蛋白在采后果蔬诱导抗病性中的研究进展

焦文晓，王晓梅，范新光，姜微波

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

采后贮藏过程中，由于果蔬的成熟和衰老，其抗病性逐渐降低，因而极易受到病原菌侵染而导致腐烂。据报道，发达国家每年约有20%的果蔬损失于采后腐烂，发展中国家每年约有50%的果蔬损失于采后贮运环节[1]。为了减少采后病害和经济损失，目前控制采后病害的主要手段是使用化学杀菌剂，但因其易造成化学残留、引起环境污染、危害人类健康，并且诱导病原物产生抗药性等问题而逐渐受到限制。随着植物诱导抗病理论和技术的进步，诱导抗病性已成为一种安全、有效的采后病害控制措施。利用物理、化学以及生物激发子诱导果实病程相关蛋白的基因表达，导致病程相关蛋白的积累，从而使果蔬具备了比未诱导果蔬更快更强的表达防卫反应以应对生物与非生物胁迫的能力，这也是著名的“priming”抗病机制。研究报道，抗病蛋白的积累是植物系统获得抗性（Systemic acquired resistance,SAR）被诱导的标志[2]。目前，尚未见有关病程相关蛋白在采后果蔬诱导抗病性中的综合分析报道。本文重点综述了果蔬病程相关蛋白的分类、功能、诱导表达，以及蛋白组学技术在果蔬采后PRs表达水平上的应用，旨在为果蔬病程相关蛋白的研究提供有益的借鉴和参考。

1 病程相关蛋白的分类及功能

早在1970年，Gianinazzi等用烟草花叶病毒（TMV）感染烟草后，发现叶片中能产生一种或者多种低分子量的蛋白质，后在1980年被Antoniw等命名为“病程相关蛋白”（Pathogenesis-related proteins，简称 PRs）。后续研究发现，PRs广泛存在于高等植物中，具有相对低的分子量，稳定性较大，多存在于胞间等特点，是植物中研究较为深入的生化抗病因子。根据其生物活性和血清学关系将PRs分为17个家族[2]，目前在采后病害防治的研究已涉及多种水果和蔬菜（表1）。

表1 果蔬中的病程相关蛋白家族Table 1 Families of pathogenesis-related proteins in fruits and vegetables

PR1最初在TMV侵染烟草抗病反应中产生，PR1过表达能提高植物抗TMV能力，在植物防御反应中起重要作用，是病原菌诱导SAR产生的标记，但是其生物活性还没有被阐述[28]；PR2具有β-1,3葡聚糖酶活性，能够降解β-1,3葡聚糖苷，破坏真菌细胞壁；PR3、PR4、PR8、PR11 都属于内切几丁质酶家族蛋白，能够抵御真菌侵染，另外，PR8还具有溶菌酶活性，可直接作用于细菌，减轻病害[2]；PR5类甜蛋白是一种具有多种生物学活性及重要功能的植物防御蛋白，具有β-1,3葡聚糖酶活性，能够结合β-1,3葡聚糖苷，从而降解真菌细胞壁，具有抗菌活性[29]；PR6具有蛋白酶抑制剂活性，同时PR6和几丁质酶都可抵御线虫和食草性昆虫[2]；PR7具有内切蛋白酶活性，是西红柿中最显著的抗病蛋白，对真菌细胞壁有一定溶解作用[23]；PR9是典型的过氧化物酶，能够通过催化组织木质化从而使细胞壁增厚，增强对多种致病菌的抗性[30]；PR10与核糖核酸酶具有相似结构，部分PR10在体外具有核糖核酸酶的活性和抗菌活性，可抵御病毒侵染[31]，最近研究显示PR4也具有核糖核酸酶的活性[32]；防御素（PR12）和硫堇化合物（PR13）具有细胞膜通透性，能使真菌或者细菌病原体质壁分离，阻止其生长繁殖，PR12、PR13和PR14都具有广泛的抗细菌和抗真菌的活性[33-35]；PR15、PR16最近被加入PRs家族，存在于单子叶植物，属于草酸氧化酶和类草酸氧化酶，具有萌发素活性，能使细胞壁再塑，从而阻止病原物的入侵，部分PR15、PR16具有超氧化物歧化酶活性，通过催化超氧阴离子和水，产生过氧化氢，而过氧化氢可对病原菌产生毒性或者作为信号分子刺激植物产生抗性响应[36-37]；在感染的烟草、大麦和小麦中发现一种PR17，有类似于含锌蛋白酶活性位点序列，但其生物活性尚不清楚[38]。

2 激发子诱导PRs表达

人们首先发现植物受到病虫害侵染后能够诱导产生自然抗性反应（Natural disease resistance，NDR），并将这种抗性称为诱导抗性（Induced resistance）。激发子是一类能激活宿主植物产生防卫反应的特殊化合物，一般包括物理激发子（如热处理、紫外线照射、电离辐射等）、化学激发子（水杨酸、茉莉酸甲酯、草酸、硅等）和生物激发子（主要是生物拮抗菌等），一些激发子不仅能够激活宿主自身抗性系统,而且能够诱导果实PRs的表达。

2.1 物理诱导PRs

热处理可通过杀死或者抑制病原菌的生长，从而达到防腐保鲜的目的[39]。研究表明，热处理可通过诱导积累PRs，进而提高果蔬自身抗性的作用。陈丽等[7]用52℃热水处理香蕉3 min后发现，热水处理诱导了香蕉果皮几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等病程相关蛋白酶活性的升高。Wang等[8]发现热激处理后的杨梅果实几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶及POD活性都显著提高。低剂量的短波紫外辐射（波长190~280 nm）能够控制采后病害，减少果实腐烂。紫外灯照射桃果实可快速诱导果实几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶等病程相关蛋白的积累，并在处理后96 h达到最大值[10]。

2.2 化学诱导PRs

水杨酸作为一种重要的内源性信号分子，可以诱导特定的抗性生理反应以及抗性蛋白的表达。Xu等[12]采用外源水杨酸处理甜樱桃发现，果实几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶显著提高，且诱导了几丁质酶基因的表达。Qin等[40]研究发现，将甜樱桃果实在0.5 mmol/L水杨酸溶液中增压（103 kPa）浸泡4 min，可显著提高低温贮藏期间β-1,3-葡聚糖酶的活性。Zeng等[41]报道了1 mmol/L水杨酸处理芒果后，果实β-1,3-葡聚糖酶活性明显高于对照组，从而减少了果实炭疽病的发生，并减缓了病斑直径的扩展。

S-甲基苯并[1,2,3]噻二唑-7-硫代羧酸酯（BTH）是第一个人工合成并且商品化的化学激发剂，属于水杨酸类似物，能够诱导植物SAR基因并积累PRs[14,42]。研究报道，一些低聚果糖如牛蒡低聚果糖能够诱导水杨酸途径从而诱导果实产生SAR。Sun等[4]研究了牛蒡低聚果糖处理葡萄诱导了果实PR1基因的表达，并且增强PRs（几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶）酶活性，从而诱导了果实水杨酸依赖的抗病途径。

茉莉酸类物质是植物天然合成的介导生物胁迫和非生物胁迫的一类信号分子，在植物成熟和果实发育过程中起重要作用，典型代表有茉莉酸和茉莉酸甲酯。Yao等[13]研究发现，采前用2 mmol/L水杨酸和0.2 mmol/L茉莉酸甲酯分别处理甜樱桃果实，能够显著诱导两种PRs（β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶）的活性，从而抑制真菌病害。Wang等[43]研究发现，茉莉酸甲酯处理可激发杨梅果实的“priming”响应，并且诱导果实几丁质酶活性的增强。许多研究证明，壳聚糖和壳寡糖对采后果蔬多种病原菌的繁殖和生长都有抑制作用，能诱导果蔬抗病性的增强，同时促进PRs（主要是几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶）活性的提高[24,44]。此外，Chen等[45]研究证明壳寡糖能诱导植物病程相关蛋白基因PR1、PR10、几丁质酶及β-1,3-葡聚糖酶基因的表达。

2.3 生物诱导PRs

利用生物拮抗菌减轻果蔬采后病害具有巨大的潜力，它们通过产生对病原菌生长有抑菌作用的物质，或者通过快速生长繁殖在寄主伤口处竞争营养和空间，或者诱导寄主产生抗性相关蛋白酶（主要包括PRs家族和酚类代谢的一些酶）等方式来提高果蔬抗病性。Xu等[11]用四种酵母拮抗菌（Pichia membranaefaciens,Cryptococcus laurentii,Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis）处理桃果实，显著减轻了Monilinia fructicola引起的真菌病害，拮抗菌提高了两个PR蛋白（几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶）活性，并且诱导了相关基因的表达。Liu等[18]研究发现致病菌（Botrytis cinerea）和拮抗酵母（Candida oleophila）侵染苹果果实时PR8基因表达明显上升，而PR5基因却没有。El-kereamy等[25]用病原菌Momilinia fructicola处理李子，发现处理后果实PR10基因表达量上调。

2.4 结合诱导PRs

不同激发子的结合使用具有广阔的应用前景。用2%CaCl2(m/V)和酵母拮抗菌（Pichia membranifaciens）分别或者结合处理荔枝果实，结合处理的果实中两个PR蛋白（几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶）活性分别高于单独处理组，且可明显抑制果实炭疽病引起的腐烂[16]。Liu等[17]采用38℃热空气处理荔枝果实36 h或者用拮抗菌Pichia guilliermondii处理果实，二者都显著诱导了PR蛋白β-1,3-葡聚糖酶的积累，研究发现两种方式结合处理效果最好，且β-1,3-葡聚糖酶活性最高。Guo等[20]在研究茉莉酸酯和拮抗酵母处理柑橘果实后，其PR5基因的表达量显著高于单独处理和对照处理，说明了PR5基因能够被诱导表达并且积累蛋白从而提高果实抗性。乙烯利处理香蕉能够诱导果实PR1基因的表达，BTH和茉莉酸甲酯单独处理时却没有诱导PR1基因表达，而研究乙烯利、BTH和茉莉酸甲酯三者结合处理香蕉，可明显观察到果实PR1基因表达上升，结果证明了BTH和茉莉酸甲酯依赖乙烯诱导途径诱导香蕉抗性[5]。

综上所述，目前对于激发子诱导的病程相关蛋白主要集中在几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶以及过氧化物酶的研究，也有部分关于PR5、PR10等病程相关蛋白的研究。由于受到蛋白酶活检测手段的限制，对于其他PRs的研究主要依靠分子生物手段，即研究其基因的表达。但是因为氨基酸残基种类远多于核苷酸残基，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰（磷酸化和糖基化等），所以对于果蔬中存在的其他病程相关蛋白及它们在果蔬采后抗病过程中诱导表达作用的研究可借助于蛋白组学技术。

3 利用蛋白组学技术研究果实采后病程相关蛋白的表达

近几年随着蛋白质组学研究的发展，利用该技术研究采后果蔬病害防御过程中抗病蛋白的变化已成为热点。早期的蛋白组学技术以双向凝胶电泳-质谱技术为主，用来分析蛋白的表达，现代蛋白质组学蛋白分离主要有基于凝胶和色谱分离两大技术体系，前者包括经典的双向电泳（Two-dimensional electrophoresis,2-DE）和新型的双向荧光差异凝胶电泳技术（Two-dimensional fluorescent difference gel electrophoresis,2D-DIGE），后者包括同位素亲和标签（Isotopecoded affinity tag,iCAT）和同位素标记相对和绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术。此外，还有蛋白质芯片（Protein chip）技术和毛细管电泳（Capillary electrophoresis）技术等。

Chan等[46]利用双向电泳技术研究了生防菌和水杨酸处理桃果实后蛋白质组的变化。鉴定了25个差异表达的蛋白质，包括参与蛋白质代谢、防御反应、能量代谢和细胞结构相关的蛋白质。其中，6个抗氧化蛋白质和3个PR蛋白质被拮抗酵母或水杨酸诱导。研究报道利用蛋白组学技术分析灰霉菌污染的西红柿果实的蛋白组，结果发现，绿熟西红柿相比于红熟西红柿和不能成熟的绿熟果实，其中所含的抗性相关蛋白较少[47]。Yao等[48]利用电泳分离和质谱鉴定技术研究葡萄与灰霉菌互作，筛选到PR类蛋白、NBSLRR类等多种抗病相关蛋白。Fan等[49]利用iTRAQ技术比较了对照组甜橙、感病品种与抗病品种的蛋白变化情况，共鉴定出了686个蛋白，其中与外界胁迫相关的蛋白（主要是PRs）发生显著上调。双向电泳技术是目前蛋白质组学研究的主要方法，然而该技术存在操作复杂，蛋白检测范围有限等问题，而逐渐被一些新的技术所取代。iTRAQ技术作为一种新的功能强大的分析蛋白技术，与传统技术相比，不仅可以发现并检出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10 kD或者大于200 kD的蛋白，而且可标记所有酶解肽段，提高了蛋白质鉴定的覆盖率和可信度等。随着基因组和植物蛋白数据库的不断完善，iTRAQ技术在果蔬采后病理学中的应用方面将会发挥更大的潜力。

4 展望

目前对于病程相关蛋白的研究多集中在植物体上，由于果实采后的表达与植物本身的抗性表达会有很大差异，所以有关果实采后病程相关蛋白的研究还需要大量的工作。①在诱导果实PRs激发子的研究方面，寻找新型、高效、无毒的激发子或结合激发子，并提高蛋白质检测手段（如运用蛋白组学技术），阐明激发子诱导果实抗性，积累抗性蛋白的机制，这在提高采后果蔬的抗病能力方面具有重要的理论指导意义；②对于PRs生物功能的研究方面，进一步阐明PRs在果蔬采后抗病过程中的重要作用，解析病程相关蛋白的其他生物学性质，如已有研究报道一些PRs是果蔬过敏原的主要来源，据报道PR14是桃、梨和甜橙等水果的主要过敏原，PR10基因是草莓和苹果的过敏原基因，而苹果、樱桃中的PR5也可导致过敏等[27]；③对果蔬PRs结构性质的研究方面，已经报道不同类群内的病程相关蛋白的基因高度分化，同一类群PRs基因也都有不同的类型，那么果蔬中所含有的不同类型的PRs是否具有相近的功能，或者说的不同分支PRs是否具有不同的生理功能，这仍然是一个需要深入研究的课题。