内生细菌TY-6对樱桃采后灰霉病菌的抑菌效果和定殖特性研究

张立新，张晓宇，高振峰，张新宪

（山西省农业科学院农产品贮藏与保鲜研究所，山西 太原 030031）

甜樱桃（Prunus avium）作为樱桃的一个古老栽培物种，虽然同香蕉、橙子、苹果和梨等大宗水果相比，属小宗水果，规模化种植面积少，但果实色泽鲜艳、香甜可口、营养和药用价值高，深受人们喜爱，产量和种植规模呈逐年扩大趋势[1-2]。然而，我国甜樱桃由于皮薄组织鲜嫩，采摘、运输期间易受损伤和病害侵染，因此贮藏期间，常因侵染性病害发生，导致腐烂，从而缩短其贮藏期并降低商品价值，在一定程度上限制了我国樱桃产业发展[1,3-4]。近年来，课题组在樱桃贮藏期间发现，多数腐烂果实表面密生灰色霉层，不仅与灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染症状相似，而且经平板分离、纯化和真菌通用引物ITS1/4鉴定后该灰霉病菌（B.cinerea）同B.cinereaIT11-17（GenBank：MF945557.1）序列相似比较高为99%（待发表），对樱桃贮藏期间品质影响较大，因此，樱桃采后灰霉病防治对其贮藏期延长和商品价值保持具有重要意义[5-7]。

虽然目前有关樱桃采后病害研究已有所报到，但主要集中在物理防腐和化学防腐中，如：王雷[8]采用热空气（HA）、茉莉酸甲酯（MeJA）及β-氨基丁酸（BABA）等不同激发子对其采后青霉病进行了研究；董维[9]和Marquenie等[10]采用短波紫外（UV-C）技术对其采后腐烂控制进行了研究；杨娟侠等[11]采用二氧化氯对甜樱桃采后青霉和灰霉病防治效果进行了研究；王宝刚等[12]采用气调保鲜技术对樱桃采后保鲜效果和病害防治进行了研究；甘瑾等[13]和Romanazzi等[14]分别采用漂白紫胶和短暂减压-壳聚糖涂膜处理对樱桃常温贮藏期间的病害防治和品质控制进行了研究，并取得一定效果。虽然这些研究对樱桃采后病害控制和保鲜效果具有一定作用，但物理措施存在操作费时和成本高等缺点；化学保鲜存在残留和病原菌抗药性等问题，因此新型低毒、经济、高效的贮藏方式仍是亟需解决的技术问题[3]。

生物防治作为一种利用生物活体或其活性成分进行病害防治的新生措施，同上述措施相比具有低毒、无残留、高效和安全等优点[15-19]，成为近年来果蔬采后病害防治的研究热点。该技术虽然目前在樱桃采后病害生物控制和保鲜方面已有研究，但主要以植物提取为主[1,20]，而有关拮抗微生物在樱桃采后保鲜方面的研究还未见相关报道。因此，本研究以樱桃采后灰霉病菌内生拮抗细菌分离和筛选为主，并对其采后活体防效和伤口定殖特性进行研究，旨在为樱桃采后生物保鲜提供新思路和相关技术开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

甜樱桃（红灯）采自山西省绛县史村樱桃种植园。

樱桃灰霉病菌（Botrytis cinerea）由课题组采用组织块分离法分自甜樱桃（红灯）病果，并经ITS1/4真菌通用引物鉴定，由山西省农业科学院农产品贮藏与保鲜研究所采后病理室保存与提供。

营养琼脂（NA）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基制备：参照张晓宇等[21]的配方进行配制。

试剂：无水乙醇，上海国药集团化学试剂有限公司产品；10%次氯酸钠，天津市致远化学试剂有限公司产品；利福平，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

SW-CJ-1D/1G型超净工作台，BSA224S-CW型电子分析天平，DH3600型电热恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 樱桃内生细菌的分离与纯化

随机选取采后健康樱桃果实5粒（0℃贮藏20d），清水洗净后，于超净工作台中使用75%乙醇浸泡3 min，3%次氯酸钠浸泡4 min，无菌水冲洗3次，晾干后，使用无菌刀片将果实切块，转移至无菌研钵中加10 mL无菌水研磨，将研磨液稀释104倍后，取120 μL涂布于NA平板上，以最后一次无菌水冲洗为对照，28℃恒温培养3 d后，依据菌落形态、颜色，采用划线法进行纯化，获得纯培养物后于4℃保存备用。

1.2.2 樱桃采后灰霉病菌拮抗细菌筛选

参照高振峰[22]采用平板对峙法，以樱桃采后灰霉病菌为靶标对“1.2.1”中分离纯化到的内生细菌进行筛选。于26℃恒温培养7 d后，采用十字交叉法测定对照组和处理组菌落直径，并参照其计算方法计算抑菌率。各处理和试验均重复3次。

抑菌率（%）=（对照组病原菌落直径-处理组病原菌落直径）/（对照组病原菌落直径-5 mm）×100

1.2.3 樱桃内生拮抗细菌TY-6对樱桃灰霉病菌的活体防效研究

选取大小、成熟度相近的樱桃果实，采用针刺接种法对拮抗细菌TY-6的樱桃灰霉病菌活体抑菌效果进行研究。每处理30粒果实，重复试验3次。

1.2.3.1 拮抗细菌TY-6菌悬液的制备

采用接种环挑取5环拮抗细菌TY-6于500 μL无菌水中，使用无菌水稀释并用血球计数板计数，使其菌悬液浓度为1.0×107CFU/mL，室温放置用于后续试验。

1.2.3.2 灰霉病菌孢子悬浮液的制备

采用直径为5mm打孔器，于活化培养10d产孢后的新鲜平板上打取3块菌饼，置于装有5 mL无菌水的10 mL离心管中，涡旋3 min后，使用血球计数板计数，并使用无菌水稀释制得孢子浓度为1.0×107CFU/mL的病菌孢子悬浮液。

1.2.3.3 病原孢子悬液和拮抗细菌TY-6菌悬液接种

采樱桃果实经表面消毒（消毒方式同“1.2.1”），晾干后，使用接种针进行针刺破伤（伤口直径约为3 mm，深度5 mm），于伤口处接种灰霉病菌悬浮液20 μL，液体被果实完全吸收后，再于伤口处接种拮抗细菌TY-6菌悬液20 μL，待其被果实吸收后，置于放有1块沾有无菌水的脱脂棉塑料托盘（长18 cm，宽12.5 cm）中，使用保鲜膜密封后，置于20℃恒温箱培养5 d后，使用坐标纸拓下病斑形状，计算病斑面积（mm2）和拮抗细菌TY-6防治效果。

病斑面积计算：使用坐标纸拓下病斑形状后数格子。计算格子时，叶片边缘凡超过半格的计算为1，不足半格则不计数。每个格子长宽各为10 mm，所以面积为100 mm2。因此，数出的格子数就是叶片的面积数（单位为 mm2）。

防治效果（%）=（对照病斑面积-处理组病斑面积）/对照病斑面积×100

1.2.4 樱桃内生拮抗细菌TY-6在樱桃果实中的定殖特性

1.2.4.1 拮抗细菌TY-6利福平抗性诱导

采用平板诱导法，将拮抗细菌TY-6接种至利福平浓度为0.2 μg/mL的含药平板中，待其可以稳定生长后转至下一个利福平浓度。利福平浓度增加梯度为前一浓度的2倍，直至拮抗细菌TY-6可在含利福平浓度为300 μg/mL的平板上稳定生长后，用于拮抗细菌TY-6樱桃定殖特性研究。

1.2.4.2 拮抗细菌TY-6樱桃定殖特性测定

选取果实大小相近和成熟度类似的果实，采用“1.2.3”中相同的方法制造伤口和拮抗细菌TY-6菌悬液后，将20 μL浓度为1.0×107CFU/mL的拮抗细菌菌悬液接种至樱桃果实伤口，置于20℃和0℃下分别恒温培养5 d和15 d，每隔1 d参照张晓宇等[23]的方法收集材料，研磨后于利福平浓度为300 μg/mL的平板上观察拮抗细菌TY-6在樱桃伤口处的定殖特性，并计算菌落数量，连续测定5 d，以接种无菌水为对照。每处理15粒果实，各试验和处理均重复3次。

1.2.5 樱桃内生细菌TY-6的16S rRNA序列鉴定

1.2.5.1 基因组DNA提取

参照Gao等[24]描述的方法对内生细菌TY-6基因组DNA进行提取，使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用于16S rRNA序列PCR扩增。

1.2.5.2 PCR扩增

使用细菌通用引物27F/1492R[25]，参照Gao等[24]中的PCR反应体系和扩增程序对菌株TY-6的16SrRNA序列进行扩增，电泳检测合格后由北京华大基因进行测序。获得菌株TY-6 16S rRNA序列后同相关模式菌株进行序列比对，并选取近缘种使用MEGA5.0邻接法（NJ）构建系统发育树，从而确定樱桃内生细菌TY-6的分类地位。

1.2.6 数据处理

采用Execl统计数据后，使用SPSS17.0进行差异显著性分析；使用Sigmaplot10.0软件制作折线图；使用PS软件对图片进行裁剪编辑。

2 结果与分析

2.1 樱桃内生细菌的分离、纯化结果

采用研磨法[22]和划线法[22]对樱桃内生细菌进行分离和纯化后，从樱桃组织中可得到8株形态和颜色具有明显差异的内生细菌（图1），说明樱桃果实中也含有一定量的内生细菌，验证了植物内生细菌存在于绝大多数植物组织中的这一观点[26]。

2.2 樱桃采后灰霉病拮抗细菌筛选结果

以樱桃采后灰葡萄孢菌为靶标，采用平板对峙法[22]对从樱桃健康果实中分离出的8株内生细菌的抑菌活性进行测定后发现，内生细菌TY-6抑菌活性最强，抑菌率为89.08%（表1，图2），其次为菌株TY-3，抑菌率73.27%，其余菌株抑菌效果均较差，抑菌率均低于50%（表1），说明内生细菌TY-6在樱桃采后灰霉病菌防治中具有较好应用潜力。

表1 樱桃内生细菌对樱桃采后灰霉病菌的抑菌效果Table 1 Antifugnal effect of endophytic bacteria of cherry against B.cinerea

2.3 樱桃内生拮抗细菌TY-6对樱桃灰霉病菌的活体防效

通过试验，得到拮抗细菌TY-6在菌液浓度为1×107CFU/mL时，对樱桃采后灰霉病菌具有良好抑菌效果，经该菌株处理后处理组的病斑面积仅为82.6 mm2，而对照病斑面积为396.7 mm2，防效为79.18%（表2，图3），同平板离体抑菌效果差异不大。说明樱桃内生拮抗细菌TY-6不仅具有良好的离体抑菌效果，而且在樱桃果实上仍可表现出较好防效，因此，在樱桃采后灰霉病害防治中有应用潜力。

表2 拮抗细菌TY-6对樱桃采后灰霉病菌的活体防效Table 2 Control effect of antifugnal bacteria TY-6 against B.cinerea in vivo

2.4 拮抗细菌TY-6在樱桃伤口处的生长动态

不同温度下，拮抗细菌TY-6于樱桃伤口处的菌落数量均呈现出先下降、后上升然后趋于平稳的变化趋势。在20℃下，接种3 d后伤口处菌株数量趋于平稳，保持在2.22×105CFU/g左右（图4 A），且高于初始值2.0×105CFU/g，而在0℃下则在接种8 d后菌株数量趋于稳定，菌株数量保持在1.15×105CFU/g左右（图4 B），说明不同温度对拮抗细菌TY-6的定殖特性具有一定影响，且在较高温度下菌株形成稳定之后会出现繁殖过程。另外对不同温度下的定殖效果进行比较后还可发现，菌株TY-6在20℃定殖效果优于0℃，其伤口处的菌株数量约为0℃下的2倍（图4），说明在低温环境应用中应注意提高菌株起始浓度。

2.5 拮抗细菌TY-6的16 S rRNA序列鉴定

使用27F/1492R细菌通用引物，对拮抗细菌TY-6的16S rRNA序列进行PCR扩增，由北京华大基因测序后获得长度为1 415 bp的16S rRNA，序列NCBI登录号为MH174081。

菌株TY-6 16S rRNA序列同相关模式菌株的16SrRNA序列进行序列比对后发现菌株TY-6同模式菌株BacillustequilensisKCTC13622T（AYTO01000043）和Bacillus subtilissubsp.inaquosorumKCTC 13429T（AMXN01000021）序列同源性最高，序列相似比均为99.93%。随后选取近缘种16S rRNA序列使用MEGA5.0构建NJ系统发育树（图5），结果表明：菌株TY-6同模式菌株Bacillus tequilensisKCTC 13622T（AYTO01000043）聚在同一支，说明菌株 TY-6与Bacillus tequilensis具有较高同源性，因此将菌株TY-6鉴定为Bacillus tequilensis。

3 结论与讨论

植物内生细菌存在于宿主植物体内，是可与宿主植物和谐共存的一类微生物，它同其他表面细菌相比因其生存环境稳定，且在宿主体内定殖后可形成病菌侵染的预防屏障，而具有良好应用潜力。本试验对樱桃采后果实中的内生细菌进行研究，对樱桃采后果实中的内生细菌进行分离、纯化后，共获得了8株形态和颜色存在明显差异的内生细菌。内生细菌分离数量同姜（5种）、蒜（3种）和苹果（1种）相比较多[27]，数量差异可能与植物种类、样品放置时间和消毒处理有关。以灰霉病菌为靶标，对这8株内生细菌的抑菌效果研究发现仅有菌株TY-3和TY-6表现出较好抑菌活性，抑菌率分别为73.27%和89.08%，其余菌株抑菌活性均低于50%，菌株TY-6对灰霉病菌抑菌活性同蟠桃、红枣和哈密瓜内生细菌[28]相比抑菌活性较好，菌株TY-6在樱桃采后灰霉病害防治中具有较好应用潜力。

本文研究了樱桃内生细菌对灰霉病菌的离体活性，筛选出抑菌活性较好的TY-6菌株进行果实上活体的抑菌效果，并对伤口定殖特性进行分析，结果发现，拮抗细菌TY-6不仅在樱桃果实上同样具有较好抑菌活性，而且还可在果实伤口处良好定殖，从而起到保护作用，防止病菌侵染或在体内发挥抑菌效果，抑菌潜伏病菌生长，说明拮抗细菌TY-6在樱桃采后灰霉病防治中具有较好应用潜力。另外，拮抗细菌TY-6在20℃下定殖效果明显优于0℃下，且0℃下形成稳定定殖时间较长，说明拮抗细菌TY-6在低温下使用时需加大菌悬液浓度，才可形成同20℃相似的定殖效果，该研究结果同张晓宇等[23]在梨果上的研究结果存在一定差异，造成这种差异的原因可能与菌株种类、水果种类不同有关。

通过与模式菌株进行比对分析后发现，拮抗细菌TY-6同模式菌株Bacillus tequilensisKCTC 13622T（AYTO01000043）和Bacillus subtilissubsp.inaquosorumKCTC 13429T（AMXN01000021）序列同源性最高，序列相似比均为99.93%。随后选取近缘种16S rRNA序列使用MEGA5.0构建NJ系统发育树，得到菌株TY-6同模式菌株Bacillus tequilensisKCTC 13622T（AYTO01000043）聚在同一支，说明菌株TY-6与Bacillustequilensis具有较高同源性，因此将菌株TY-6鉴定为Bacillus tequilensis。

虽然本研究从樱桃果实上分离到8株内生细菌，并筛选出1株对樱桃采后灰霉病菌具有良好防治效果的拮抗细菌TY-6，且可在樱桃伤口稳定定殖，但有关拮抗细菌TY-6的半最大效应浓度（EC50）、分类地位、对樱桃其他采后病原物的抑菌效果及保鲜效果等相关研究还需进一步开展，从而为樱桃采后病害生物防治提供新选择和参考依据。