重组胰岛素生长因子-1对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的研究*

杨玲玲 何艳桃 王宇欣 马会明 徐 仙

1 宁夏医科大学，宁夏银川市 750004； 2 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室； 3 宁夏医科大学总医院生殖医学中心

颗粒细胞与卵泡的发育密切相关，它的状态及其数量可作为预测卵泡发育能力、胚胎质量以及妊娠结局生物学标志物[1-3]。颗粒细胞的生理功能主要依赖于外周血中的生殖激素(FSH、LH、E2和雄激素)以及卵泡微环境中自分泌和旁分泌的细胞因子(IGF-1、TGF-α等)，它们对颗粒细胞的增殖、发挥生理功能以及对卵泡成熟和排卵很重要[4]。研究发现，IGF-1是促进颗粒细胞增殖、发挥生理功能的重要因子。适当浓度的IGF-1作为颗粒细胞重要的有丝分裂原，可促进FSH对颗粒细胞的调节作用[5]，同时通过影响P450的生成促进颗粒细胞芳香化酶的活性，使E2水平升高，进而促进卵泡的发育[6]。且有研究证实IGF-1与LH、FSH、GH、hCG、IGFs有协同作用，共同促进颗粒细胞增殖[7]。因此，积极寻找IGF-1对小鼠颗粒细胞增殖作用的最佳时间是本研究的重点。

1 材料与方法

1.1 动物来源 具有正常动情周期的清洁级雌性昆明白4周龄小鼠(质量18～22g)，购自宁夏医科大学实验动物中心[许可证编号SCXK(宁)2015-0001]，动物饲养条件:温度(22±2)℃;湿度50%～65%,光照周期12h∶12h,通风良好,标准饲料,自由进食饮水。

1.2 实验材料 TCM199：美国 Gibco公司；胎牛血清：美国 Gibco 公司；青、链霉素、0.05% Trypsin-EDTA(1x):GIBCO；C57颗粒细胞系：上交大医学院吴际教授赠送；低温离心机：德国Eppendorf公司；二甲基亚砜：美国 Sigma 公司；IGF-1：北京科昕生物科技有限公司；超净工作台：新加坡ESCO公司；96孔板：COSTAR公司；37℃ 5%的CO2细胞培养箱：HEAL FORCE 公司；CCK-8试剂盒：大连美仑生物技术有限公司；多功能酶标仪：美国Thermo Fisher公司;全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒：中国江苏凯基生物公司；蛋白Mark：美国Thermo Fisher公司；蛋白电泳仪：美国BIO-RAD；PCNA：中国北京博奥森公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠卵巢颗粒细胞的培养及分组：按照实验室常规方法[8]，取小鼠颗粒细胞培养后，吸取细胞混合液移至1.5ml EP管中，离心弃上清液。加入TCM199培养基吹打混匀，置于60mm培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱内培养，次日更换新鲜TCM199。当细胞培养至 70%～80%时，加入胰蛋白酶(含EDTA)0.5/60mm消化、进行western blot实验。

1.3.2 实验分组：小鼠颗粒细胞接种至培养皿，细胞密度调整为1×104个，每组设置3个平行培养皿，并设不含细胞的空白培养皿，减少CCK-8检测误差。实验分为两组:空白对照组和IGF-1 培养组，空白对照组是基础培养基TCM199培养基，含100U/ml双抗、10%FBS、EGF等。IGF-1 培养组是在空白对照组的基础上添加100ng/ml的IGF-1，对两组细胞37℃ 继续培养。

1.3.3 CCK-8检测颗粒细胞增殖情况：将对数生长期的颗粒细胞以每孔3×103接种于96孔培养板中，平行接种两组，设6个复孔；每孔加完全培养基100μl。在37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，用完全培养基将IGF-1配置成100ng/ml浓度加入实验组，对照组只加完全培养基。分别在培养后6h、9h、12h加入CCK-8试剂10μl,再孵育4h,在波长450nm下，用酶标仪检测培养细胞光密度(OD)。

1.3.4 Western blot检测PCNA蛋白的表达：两组颗粒细胞培养9h后，清洗，消化并裂解细胞，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)定量试剂盒测蛋白浓度。上样蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗PCNA(浓度1∶800)，4℃孵育过夜，TBST漂洗4次，加入鼠二抗(1∶20 000)，室温摇床孵育1h，超敏ECL化学发光法显影，曝光。

2 结果

2.1 CCK-8检测颗粒细胞增殖情况 CCK-8结果可见，与空白对照组相比，IGF-1培养组增殖能力显著增加(P<0.05)，IGF-1培养6h、9h、12h后，小鼠颗粒细胞在9h增殖速度最快，继续培养出现不同程度的抑制作用。见图1。

图1CCK-8检测各时间段OD值

注：两组比较，**P<0.05。

2.2 Western blot检测颗粒细胞增殖标记PCNA蛋白表达水平 PCNA可间接反映细胞增殖情况，IGF-1培养组中PCNA蛋白表达量显著上调，差异有统计学意义(P<0.01)，反映IGF-1培养组颗粒细胞较空白对照组增殖快。该实验独立重复3次。见图2。

图2Westernblot检测PCNA蛋白表达及灰度值分析

注：两组比较，**P<0.01。

3 讨论

卵泡生长发育异常可能是引起患者不排卵及内分泌改变的病理基础，卵巢卵泡生长发育异常与颗粒细胞的增殖调控密切相关。研究证实：调节卵泡生长发育的生长因子都参与颗粒细胞增殖的过程[9-10]。IGF-1是一类多肽生长因子，由70多个氨基酸组成，其编码基因位于12号染色体短臂上[11]，其主要作用之一就是在卵泡发育的不同阶段促进颗粒细胞增殖、分化，抑制颗粒细胞凋亡，维持细胞的生存，其通过自分泌和旁分泌的方式发挥作用。IGF-1对颗粒细胞的增殖主要通过促进颗粒细胞有丝分裂、刺激RNA和DNA合成作用，从而促进颗粒细胞增殖[12-13]。有学者研究发现[14-15]，体外培养的颗粒细胞单一添加FSH或IGF-1均能使激素合成增加，当同时添加FSH和IGF-1时，培养液中E2合成增加。由此推断IGF-1可增强促性腺激素促进卵泡发育。本研究结果显示，与空白对照组相比，IGF-1培养组颗粒细胞在9h细胞增殖速度最快，提示小鼠卵巢颗粒细胞经IGF-1处理后细胞增殖能力增强，该结论证实IGF-1促进卵泡颗粒细胞的增殖，进而促进卵泡发育，对生殖功能调节具有重要作用，为IGF-1在辅助生殖领域临床应用奠定理论基础。

细胞增殖核抗原(Proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合物酶δ的辅助蛋白，可参与NDA合成，广泛存在于体内增殖旺盛的细胞中，是细胞生长和增殖的标记物[16]。本研究以PCNA蛋白的表达可作为判断颗粒细胞增殖活性的标志。Western blot结果显示，与空白对照组相比，IGF-1培养组中PCNA蛋白的表达显著上调，差异有统计学意义，明确经IGF-1处理增强了颗粒细胞增殖能力，进一步证实了 IGF-1 可促进卵巢颗粒细胞增殖，促进卵泡生长,减少卵泡发育障碍，为生育力保护和保存提供很好的策略。

综上所述，IGF-1作为调节卵泡生长发育的生长因子之一，其主要的作用之一就是在卵泡发育的不同阶段促进颗粒细胞的增殖，本研究中IGF-1可显著性促进小鼠颗粒细胞在体外培养9h的增殖能力。