柳州市区及周边地区临床分离非结核分枝杆菌的菌种分布研究*

唐柳生，张 明，唐国林，廖光付，冯光辉

广西壮族自治区龙潭医院，广西柳州 545005

随着结核病防治工作的不断深入，近年来非结核分枝杆菌(NTM)感染的报道也不断增多，已成为目前研究者关注的问题。有研究报道，NTM的发病率在逐年提高，但各地报道主要致病的NTM菌种存在一定的差异，流行特征也不尽相同[1]。目前柳州市区及周边地区较缺乏相关资料，为了解近年NTM临床分离株的菌种分布情况，本研究采用微阵列基因芯片法对分布于柳州市区及周边地区人群的NTM进行菌种鉴定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2016年3月至2019年4月柳州市区及周边地区分枝杆菌临床分离株1 033株，均分离自临床患者，结核分枝杆菌标准菌株为H37Rv。

1.2仪器与试剂 抗酸染色液和改良罗氏培养基(L-J培养基)由珠海贝索公司提供。晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒、晶芯Extractor36核酸快速提取仪、PCR扩增仪、BioMixerTMⅡ芯片杂交仪、恒温水浴锅、SlideWasherTM8芯片干洗仪、LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪均由博奥生物集团有限公司提供。N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH混合溶液和pH6.8的磷酸盐缓冲液为本室自配[2]。ZDP-A2270恒温培养箱由上海智诚分析仪器制造有限公司提供。KDC-2046低速离心机由安徽中科中佳科学仪器有限公司提供。

1.3方法

1.3.1分枝杆菌培养及初步鉴定 采用改良罗氏培养基(L-J培养基)进行分枝杆菌培养，阳性菌株再用PNB和TCH鉴别培养基(PNB法)进行初步鉴定：PNB和TCH培养基均生长的菌株初步判定为NTM；PNB不生长、TCH生长或不生长的菌株初步判定为结核分枝杆菌复合群。具体操作参照分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册[2]。

1.3.2NTM的菌种鉴定 将初步鉴定为NTM的菌株用无菌的接种环挑取其菌落于核酸提取管中，95 ℃ 10 min灭活，1 200 r/min离心5 min，倾倒弃去上清液。向核酸提取管中加入80 μL核酸提取液，使用核酸快速提取仪振荡5 min后取出核酸提取管，放入95 ℃水浴锅5 min。然后12 000 r/min离心1 min，取上清液2 μL于规格为200 μL的离心管中，加入扩增试剂18 μL，用PCR扩增仪进行扩增。取6 μL相应的扩增产物与9 μL杂交缓冲液混匀，95 ℃变性5 min后冰浴3 min。将13.5 μL杂交反应混合物加到芯片上，迅速盖上杂交盒并密封，立即将密封好的杂交盒水平放入50 ℃预热的恒温水浴锅中杂交120 min。将杂交后的芯片用干洗仪进行洗涤和甩干，再通过扫描仪和相应的软件分别进行扫描和结果的判读。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1分枝杆菌菌群鉴定结果 1 033株分枝杆菌临床分离株用PNB和TCH鉴别培养基进行初步鉴定，检测出结核分枝杆菌复合群849株，占82.2%，检测出NTM 184株，占17.8%。

2.2NTM的菌种鉴定结果 184株NTM用基因芯片法进行菌种鉴定，共检测出NTM 9种，其中鸟分枝杆菌占比最大，为50.5%，其次是龟/脓肿分枝杆菌，占27.1%，胞内分枝杆菌占8.2%。绝大部分NTM分布于痰液标本。NTM感染患者中，男107例，占58.2%，女77例，占41.8%，男性感染NTM的比例高于女性(P<0.05)。NTM感染患者年龄为25～82岁，85.9%患者年龄为40岁及以上。见表1～2。

表1 9种NTM在各种标本中的分布情况

表2 各年龄段不同性别感染NTM的情况[n(%)]

3 讨 论

近年来，NTM感染所致疾病的发病率呈上升趋势[1]，可能与分枝杆菌菌种鉴定水平的不断提高、人口老龄化、免疫力低下人群增多有一定的关系[3-5]。笔者曾报道2015年柳州市艾滋病患者合并分枝杆菌感染情况：1 106例艾滋病患者的各类标本经分枝杆菌培养，共分离出分枝杆菌148株，其中NTM 27株，占18.2%[3]。其他相关研究也有类似的报道，证明人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性者是感染NTM的高危人群[4-5]。本研究结果显示，NTM在分枝杆菌中所占比例为17.8%，与笔者当年的报道大致接近，与其他研究相比，本研究结果中NTM分离率高于北方地区而低于沿海地区[6]，证明NTM的分离率在地域上存在一定的差异。

本研究采用基因芯片法进行NTM菌种鉴定，共检测出9种NTM，其中鸟分枝杆菌占比最大，为50.5%，其次是龟/脓肿分枝杆菌，占27.1%，胞内分枝杆菌占8.2%,表明柳州市区及周边地区以鸟分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌为主要流行菌株。文献[7-14]报道，北京地区和宁波地区以胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌为主要流行菌株，天津市以胞内分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌为主要流行菌株，山东、甘肃、福建省和杭州市以胞内分枝杆菌为主要流行菌株，广州市以龟/脓肿分枝杆菌为主要流行菌株。本研究和这些报道都证明了NTM的菌种分布也存在区域性的差异。

本研究显示，184例NTM感染患者中，男性占比高于女性，85.9%患者年龄为40岁及以上，60岁及以上患者占49.5%。张结等[7]报道，130例NTM感染者中，男87例，女43例，60岁及以上占40%(52/130)。本研究及以上报道均显示NTM感染者以男性居多，中老年人为NTM的易感人群。

本研究中检测出的NTM大多为痰液标本分离株，说明NTM感染大多发生在肺部。鸟分枝杆菌感染后可侵害包括肺、骨髓和淋巴结在内的多种器官和组织。临床类型主要包括单一结节、结节状支气管扩张、结节样浸润和在免疫力低下患者中的扩散性浸润4种，大多数鸟分枝杆菌菌株具有多重耐药性，给临床治疗带来一定的困难。该类患者胸部X线片上病变见于右上肺，早期临床很容易被误诊为肺结核。龟/脓肿分枝杆菌是一种快速生长的NTM，主要引起肺部和皮肤伤口感染。胞内分枝杆菌感染主要表现为慢性肺部感染。堪萨斯分枝杆菌存在于灰尘和水中，但不太容易从环境中分离。系统疾病、免疫抑制剂应用和长期暴露于污染的水中是发病的危险因素。该菌可以感染机体而不发病，直至宿主免疫功能缺陷时发病，主要侵犯肺部。戈登分枝杆菌一般情况下不易致病，在身体抵抗力低的情况下可引起机会性感染和发病。偶然分枝杆菌属于迅速生长的分枝杆菌，发病机制还不确切，吴海良等[10]报道40株NTM中偶然分枝杆菌有2株，本文报道184株NTM中偶然分枝杆菌有4株，二者比较，差异有统计学意义(χ2=174.09，P<0.01)。浅黄分枝杆菌生长速度介于慢生长菌与快生长菌之间，但此菌与快生长菌更为接近。吴海良等[10]报道40株NTM中浅黄分枝杆菌有1株，本文报道184株NTM中浅黄分枝杆菌有4株，二者比较，差异有统计学意义(χ2=177.02，P<0.01)，表明偶然分枝杆菌、浅黄分枝杆菌在柳州市区及周边地区的分离率与山东省[10]的分离率存在较大差异。苏尔加/玛尔摩分枝杆菌和土分枝杆菌的相关研究报道较少，本文报道184株NTM中苏尔加/玛尔摩分枝杆菌有4株，土分枝杆菌有1株，虽然这些菌种所占比例很少，但仍然不能忽略其带来的感染风险。

综上所述，本研究显示柳州市区及周边地区NTM的菌种分布与其他地区存在一定差异，NTM感染大多数发生在肺部，流行的NTM以鸟分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌为主，NTM感染以男性居多，中老年人为NTM的易感人群。本研究结果反映了柳州市区及周边地区近年来NTM的流行特征，为NTM感染的临床诊治工作提供了重要的参考依据。