体外法评估添加不同比例裂壶藻粉对瘤胃发酵的影响

李海庆，孙劲松，马 青，李作明，田玉富，周玉香*

(1.宁夏大学 农学院，银川 750021；2.宁夏农林科学院 动物科学研究所，银川 750021；3.宁夏农垦小尾寒羊种羊有限公司，银川 750021)

裂壶藻(Schizochytriumsp.)是一种原生生物，广泛分布于海洋、河口等地区，其主要成分为脂肪、蛋白质和糖，其中脂肪含量占干物质重25%～50%，DHA含量占15%～20%[1]。裂壶藻油有类胡萝卜素等多种天然抗氧化物质，氧化稳定性较高[2]。裂壶藻在肉羊上应用较少，本试验拟采用体外培养技术，对不同添加比例裂壶藻粉的日粮进行体外批次发酵培养，测定多项发酵指标，用以评估确定裂壶藻粉在瘤胃发酵的最佳添加比例。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

选用3月龄，体重在25 kg左右，体况良好的滩羊公羊3只，进行瘤胃瘘管手术，待瘤胃瘘管固定后护理30 d开始试验。试验前，对圈舍进行消毒，对羊只进行驱虫、健胃等管理。饲养日粮按照《肉羊饲养标准》(NY/T816-2004)合理配制营养全面的基础日粮。基础日粮营养配方，见表1。每日饲喂2次，定量饲喂1230g，自由饮水。

称取4.0 g精粗比为50∶50的日粮作为培养底物，日粮分别用裂壶藻粉按0%、1%、2%、3%比例替换玉米面，作为四个不同的处理组。添加0%组作为对照组。采用体外发酵技术，发酵开始0 h、3 h、6 h、12 h、24 h测得各点各项指标，每个处理点3个重复样，最后所测值根据组合效应综合指数(MFAEI)的计算公式，整理数据。裂壶藻粉购自厦门汇盛生物有限公司，干物质96%，粗蛋白26%，粗脂肪含量40%，DHA含量15%。

1.2 瘤胃液体外发酵

采用Menke等[3]发酵法进行。试验期间在早饲前通过瘤胃瘘管抽取瘤胃液，取出后立即放入预热39 ℃并通有CO2的保温瓶中，带回试验室。随后经8层纱布过滤后迅速分装进通有CO2的恒温培养瓶中，每个培养瓶装入40 mL瘤胃液。培养液参照张爱忠[4]的方法进行配制，每个培养瓶中加入80 mL培养液。试验前39 ℃预热并通入CO2。取250 mL培养瓶，置于恒温水浴摇床中，摇床温度设置为39 ℃，摇速50次/min，记录产气量。

1.3 测定指标

各试验点结束后，分别测定各组合的产气量、pH、中性洗涤纤维(NDF)、氨态氮浓度(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和挥发性脂肪酸(VFA)含量。

表1 基础日粮营养配方(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis)

注：预混料含量为(每kg不低于)：维生素A 224 000 IU，维生素D3100 000 IU，维生素E 700 mg，锰 1 200 mg，硒4.50mg，锌1 900 mg，氯化钠16%，钙20%，磷4%。

Note:Premix contains (per kg no less than): VA 224 000 IU，VD3100 000 IU，VE 700 mg，Mn1 200 mg，Se 4.50 mg，Zn 1 900 mg，NaCI 16%，Ca 20%，P 4%.

发酵结束后从注射器读取并记录不同时间点的产气量。用PHS-2型酸度计直接测定培养瓶中的发酵液pH。NH3-N浓度参照冯恩慈等[5]的方法测定。NDF测定参照杨胜等[6]方法进行。VFA用GC-2010气相色谱仪测定。MCP测定用差速离心法，将细菌沉淀，再用考马斯亮蓝G-250法测定[7]。

1.4 单项组合效应指数及多项组合效应综合指数

式中：A1为对照组各个培养时间点各指标数值；A2为各组各个培养时间点各指标数值；A3是在每个时间点A2总和的平均数。多项组合综合效应指数(MFAEI)为各单项指标的加和值。

1.5 数据统计与处理

所有试验数据用Excel记录并作简单处理后，用SAS 8.2软件包中的ANOVA过程进行方差分析，多重比较用Duncan法。试验结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同比例裂壶藻粉组对体外培养产气量的影响

由表2可见，在日粮精粗比50∶50情况下，体外培养产气量均随培养时间的增加而有所增加。3 h、6 h时添加比例为3%组产气量最大，对照组最小(P<0.05)。12 h时添加比例为3%组产气量显著高于其它三组(P<0.05)。24h时添加比例为2%组和添加比例为1%组值接近，显著高于添加比例为3%组、对照组(P<0.05)。

2.2 不同比例裂壶藻粉组对体外培养pH的影响

由表2可见，3 h添加比例为3%组最大，显著高于其它三组。6 h添加比例为3%组最大，对照组最小，各组有显著差异(P<0.05)。12 h对照组显著小于其它组(P<0.05)。24 h添加比例为3%组最大，对照组最小(P<0.05)，添加比例为1%组、添加比例为2%组数值接近。

2.3 不同比例裂壶藻粉组对体外培养内容物NDF消化率的影响

由表2可见，在3 h添加比例为3%组最大，对照组最小(P<0.05)；6 h对照组最小(P<0.05)，其它各组差异不大。12 h、24 h时添加比例为2%组显著高于其它三组(P<0.05)。

2.4 不同比例裂壶藻粉组对体外培养氨态氮浓度的影响

不同比例裂壶藻粉组对体外培养氨态氮浓度的影响见表2。由表2可以看出，3 h时添加比例为3%组显著高于其它三组(P<0.05)。6 h时各组差异不显著。12 h时添加比例为2%组数值最大，添加比例为1%组最小，两者差异显著(P<0.05)。24 h时各组差异不显著。

2.5 不同比例裂壶藻粉组对体外培养微生物蛋白含量的影响

由表2知，在3 h、24 h对照组最高，添加比例为3%组最小，两者差异显著(P<0.05)，其它各组间差异不显著。在6 h添加比例为1%组最大，添加比例为3%组最小，两者差异显著(P<0.05)。在12 h各组差异不显著。

2.6 不同比例裂壶藻粉组对体外培养挥发性脂肪酸的影响

由表2知，3 h时各组差异较小。6 h时添加比例为1%组最小，并且与对照组、添加比例为2%组、添加比例为3%组差异显著(P<0.05)。12 h时添加比例为2%组VFA浓度高于对照组、添加比例为2%组、添加比例为3%组，差异不显著。24 h时对照组VFA浓度最高，添加比例为3%组最低(P<0.05)。

表2 不同比例裂壶藻粉组对瘤胃发酵的影响Table 2 Effects of different proportions of Schizochytrium sp. on gas production in vitro

注：同列大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Different capital letter superscripts in the same line mean highly significant difference (P<0.01), different small letter superscripts significant difference (P<0.05), the same letter superscripts insignificant difference (P>0.05).

2.7 不同比例裂壶藻粉组体外发酵指标的综合评定

在4种不同比例组合中，多项组合效应综合指数(MFAEI)结果，最高的组为添加比例为2%组，其它为添加比例为3%组和添加比例为1%组(表3)。

3 讨 论

发酵的产气量代表着饲料的营养价值，产气量越高说明瘤胃微生物可代谢程度越高。Getachew等[8]用体外法试验，添加玉米油会提高产气量。Machmüller等[9]报道，不饱和脂肪酸会抑制甲烷的生产，可能是产甲烷菌受到了影响。Busquet等[10]用体外法评估大蒜油对瘤胃液发酵指标的影响发现，添加大蒜油降低了甲烷产量，并增加了丙酸盐比例。本试验中添加比例为3%组在3、6、12 h的产气量最大，发酵效果最好。添加比例为2%组在24 h时产气量最高，在12 h时，仅次于添加比例为3%组。添加了裂壶藻粉组产气量均比对照组高，可能裂壶藻粉的蛋白质等营养成分有益于瘤胃发酵。

Ueda等[11]、Benchaar等[12]报道奶牛日粮添加油脂对瘤胃pH没有显著影响。本试验经过人工瘤胃发酵处理后的pH维持在3.74～6.67的范围内。各组随着发酵时间延长，pH均呈现下降趋势，这可能为人工瘤胃无法排除代谢物，随着发酵时间增加，挥发性脂肪酸等代谢产品蓄积，导致pH下降。四组比较，对照组在各个时间点的pH均低于其它各组，添加比例为2%组在各个时间点的pH高于对照组，但低于其它2组。表明对照组和添加比例为2%组发酵产酸较多，可能发酵更加充分。

表3 不同比例裂壶藻粉组体外发酵指标影响的综合评定Table 3 Evaluation of fermentation index of Schizochytrium sp. in vitro by MFAEI

NDF消化率能反映瘤胃的消化率，瘤胃发酵越好，NDF消化率的值越高。Weld等[13]发现，给奶牛饲料添加脂肪不会影响瘤胃内纤维的消化率。Patra[14]研究发现，给绵羊日粮中添加适量的脂肪不会影响纤维消化率，但脂肪添加量太高时，纤维消化率会下降。各组NDF的消化率均随培养时间的增加呈现增加的趋势。在12 h、24 h时添加比例为2%组显著高于其它三组(P<0.05)。添加了裂壶藻粉的组在各个时间点上均比对照组的NDF消化率要高，说明裂壶藻粉可能有促进瘤胃发酵的作用，且添加比例为2%组消化率最高。

瘤胃NH3-N浓度代表饲料蛋白质被瘤胃微生物分解的速度及被代谢利用情况，Nolan等[15]发现瘤胃NH3-N浓度在6～30 mg/dL范围内比较合理。如果NH3-N升高,说明瘤胃微生物降解蛋白质释放NH3的速率超过了微生物利用NH3的速率,这会增加瘤胃氮循环中氮素的损失[14]。很多研究报道了饲喂植物油后反刍动物的NH3-N变化，结果是增加、降低和没有变化[16-17]。本试验中，在3 h和12 h时，添加比例为1%组的值最低。在6h、24 h各组并无显著性差异，可能各组对饲料蛋白的降解速度非常接近，表明添加裂壶藻粉对瘤胃蛋白质代谢的负面影响较小。

瘤胃内微生物蛋白质(MCP)的浓度是检测微生物对NH3-N的利用率的重要指标。饲料蛋白质被瘤胃微生物降解为NH3,然后微生物又利用酮酸和NH3合成MCP。瘤胃内环境稳定，能量和蛋白供应充足、平衡，MCP产生量最大。Wolin等[18]报道，反刍动物日粮添加油脂会降低短链脂肪酸，这些变化也可能与瘤胃微生物数量减少和蛋白水解减少有关。Hristo等[19]也发现，给育肥牛饲喂红花油能显著降低原虫数量。在3、6、12 h，添加比例为1%组、添加比例为2%组的菌体蛋白含量和对照组相比差异不大。在各时间点，添加比例为3%组均为最小组。在24 h对组组最大，其它三组差异不显著。综合看，对照组和添加比例为1%组的菌体蛋白产量最高，有较理想的发酵效果。

VFA的产量也是评估瘤胃发酵能力的重要指标之一。VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是反刍动物能量的主要来源。碳水化合物生成丙酸，粗纤维生成乙酸和丁酸。添加不饱和脂肪可能会改变瘤胃微生物，造成发酵模式的改变。Doreau等[20]报道反刍日粮中添加高油脂会对瘤胃微生物产生毒性，可以影响原虫的数量，原虫对于蛋白质和纤维降解有着很大的作用。本试验中挥发性脂肪酸的含量随着体外培养时间的增长均呈上升的趋势。

4 结 论

本研究结果表明，在精粗比为50∶50的日粮条件下，裂壶藻粉在滩羊日粮中的适宜添加比例为2%。