贝莱斯芽孢杆菌的分类、次级代谢产物及应用

陈 龙，吴兴利，闫晓刚，魏炳栋，张芳毓

(吉林省农业科学院，吉林 公主岭136100)

目前，芽孢杆菌在农业领域中发挥着越来越重要的作用。贝莱斯芽孢杆菌在自然界中广泛分布，且易于分离和培养。该菌因生长快、抗逆性强、代谢产物丰富、对人和动物安全无毒而被广泛研究人员所关注。Dunlap等[1]通过基因组学系统分类重新将Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum,Bacillusmethylogrophicus以及Bacillusoryzicola归类为B.velezesis。近年来，B.velezesis在生防菌剂领域中进行了大量研究报道。例如：B.velezensisGH1-13[2]、B.velezesisS3-1[3]、B.velezesisFZB42[4]、B.velezesisM75[5]、B.velezesisLS69[6]、B.velezesis9912D[7]、B.velezesisS499[8]以及B.velezensisSQR9[9]等。上述研究报道，B.velezesis具有丰富的次级代谢产物来竞争性的抑制植物病原微生物，有望成为高效生防菌剂的潜能。本文重点对贝莱斯芽孢杆菌在最新分类、次级代谢产物、木质纤维素利用以及饲料添加剂等方面的报道进行综述，为贝莱斯芽孢杆菌的应用奠定基础。

1 B. velezesis分类

B.velezensis首次由Ruiz-Garc'等[10]分离自西班牙南部Malaga 城市贝莱斯河河口, 该菌为革兰氏阳性细菌，可在15～45 ℃和pH 5.0～10.0的范围内生长。目前，由于Bacillusamyloliquefaciens、Bacillusmethylotrophicus、Bacillussubtilis、B.velezensis以及Bacillussiamensis具有高表型相似性，造成很多研究报道中菌株混淆和鉴定错误等现象。因此，仅以常规的鉴定方法来区分这些相似度极高的微生物，具有很大的争议[1,11]。在传统鉴定方法中，16S rRNA基因一直被认为是定义细菌分类和系统发育的经典方法，但很多研究报道的结果常常具有争议性，导致菌株鉴定的混乱[12]。最近，基于基因组学系统分类的方法，通过基因组与基因组的距离计算(GGDC)、比较基因组学构建菌株间系统发育树、平均核苷酸同源性 (ANI)以及数字DNA-DNA杂交(dDDH) 等技术相结合，被认为是鉴定和区分菌株更为精确的方法[13-15]。据文献报道，Chan等[16]认为ANI是一种公认的菌种鉴定新标准，其通过基因组间进行比对能够更加精确的区分亚种层面上的相似菌株。因此，通过基因组学分类鉴定有望成为区分芽孢杆菌菌株的精确标准；同时，为B.velezensis相似菌株在亚种分类层面上提供更为精准的方法。

在先前的报道中，发现B.velezensis的16S rRNA基因序列与Bacillusamyloliquefaciens的相似性可达99%。经过DNA-DNA亲缘值分析，Wang等[18]曾认为B.velezensis是Bacillusamyloliquefaciens的同义词。但经过比较基因组学分析发现，B.velezensisNRRL B-41580T与Bacillusamyloliquefaciens并非同种菌；相反，它与Bacillusmethylotrophicus更为相似[1]。与此同时，有文献从水稻 (Oryza sativa) 中分离的内生菌Bacillusoryzicola，该菌株在温室试验中具有植物-病原菌拮抗活性，其16S rRNA基因与Bacillussiamensis以及Bacillusmethylotrophicus序列相似度可达99.7%[19]，这使得B.velezensis及其相似菌株的区分与鉴定成为研究的热点。为了更好地区分这些相似度极高菌株的系统遗传学，Dunlap等[1]报道了BacillusoryzicolaKACC18228的全基因测序，并与B.velezensisNRRLB-41580T、BacillusmethylotrophicusKACC13015T、Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFAB42T进行了比较基因组分析，结果显示了全基因上仅有微小的差异，且菌株间DNA-DNA杂交值经比较计算后均大于84%，远高于标准物种70%的阈值，因而可视为同种菌株。2018年，Fan等[2]提出了新分类单元“operational groupB.amyloliquefaciens”的概念，如图1所示，即将Bacillusamyloliquefaciens、Bacillussiamensis和Bacillusvelezensis归为一个工作组[20]。在此基础上，Fan等进一步通过四核苷酸(TETRA)、ANI、平均氨基酸同一性(AAI)和dDDH等技术对B.amyloliquefaciens、B.amyloliquefacienssubsp.plantarum、Bacillussiamensis以及B.velezensis的相关代表菌株进行菌种分类鉴定，结果显示FZB42与B.velezensis间的TETRA, ANI, AAI, DDH 以及16S rRNA值分别为0.9991%、98.30%、99.11%、87.10%和99%, 根据微生物基因组分类标准，远远高于物种阈值。因此，将Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFAB42T更名为B.velezensisFZB42T[21]。不仅如此，这些菌株在形态学、生理学、化学分类和系统分析结果表明，它们具有表型和基因型的一致性。由于B.velezensis首次发现的时间早于其他菌株，因此，Bacillusoryzicola、Bacillusmethylotrophicus、Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum重新归类并命名为B.velezensis[1]。

图1B.velezensisFZB42的NJ系统进化树[20]
Fig.1 The NJ phylogenomic tree ofB.velezensisFZB42[20]

2 B. velezensis次级代谢产物及应用

目前，B.velezensis菌株主要分离来自植物根系，其可以通过分泌植物激素，如生长素和其他挥发性有机化合物促进作物生长[22-23]；同时，B.velezensis能够分泌多种抗生素类物质和铁载体来抑制植物病原菌，其中部分菌株有望成为商业化的生防菌剂。近年来，主要围绕B.velezensis的次级代谢产物进行了大量研究报道。研究人员通过全基因组生物信息学分析发现在B.velezensis基因组上具有许多次级代谢基因簇与抑菌化合物的合成有关。目前，研究较为清晰是B.velezensis的代表菌株FZB42，该菌分离来自玉米根系附近的土壤，在过去的二十年里，研究者们对其生物学特性和相关分子机制进行了一系列研究，结果清晰发现B.velezensisFZB42作为根系菌具有促进植物生长的生物学作用。这与B.velezesisFZB42能够分泌大量具有抗菌活性的次级代谢物密切相关。到目前为止，FZB42基因组包含13个具有公认抗菌作用的次级代谢物的基因簇。主要包括：脂肽类抗生素(surfactin、fengycin、bacillomycin D)、聚酮化合物 (macrolactin、bacillaene、difficidin、oxydifficidin)以及多肽类物质(plantazolicin、amylocyclicin、bacilysin)[24]，而次级代谢基因簇nrs和type III polyketide的最终产物至今未被鉴定。在近几年内，相关研究人员陆续报道了其他B.velezensis丰富的次级代谢产物。 Jin等[3]报道从黄瓜根际土壤中分离得到的B.velezesisS3-1，能抑制植物病原菌Botrytiscinerea，促进植物生长，且B.velezesisS3-1基因组能够合成13种脂肽抗生素，属于surfactin、iturin、fengycin家族。Blom等[25]报道BacillusvelezensisCAU B946从水稻根系中分离出来，产生多种抗生素类物质，例如：lipopeptides、polyketides和bacilysin，能够抑制由植物病原真菌引起的几种植物病害，包括：烟草黑头，稻壳枯萎病，棉花枯萎病，棉花黄萎病，小麦痂病等。最新研究发现B.velezesisSQR9的诱变菌株, 由非核糖体合成的脂肽(fengycin，bacillomycinD)、聚酮类化合物(macrolactin, difficidin, bacillaene)、二肽bacilysin、胞外多糖以及挥发性有机化合物能够有效诱导拟南芥的自身系统抗性来抵抗植物病原菌Pseudomonassyringae和Botrytiscinerea[9]。而与上述B.velezesis不同的是，Hao等报道的从小麦根系分离得到的B.velezesisYAUB9601-Y2同样可产生多种非核糖体多肽合成酶(NRPSs，nonribosomal peptide synthetases)和酮化合物合成酶(PKS，polyketide synthases)，例如：bacillomycin D、fengycin和difficidin，而在YAU B9601-Y2的基因组中还发现了合成和修饰mersacidin的完整基因簇，在其他B.velezesis菌株中并未发现[26]。由于B.velezesis大部分分离来自植物根系及土壤中，具有相同的次级代谢基因簇，但其组成和结构还需进一步验证和分析；且由于同种菌株间分离来源的不同，仍会存在次级代谢产物的差异性。

为区分不同种属芽孢杆菌在次级代谢产物方面的差异，在2018年最新研究报道中，Fan等[20]通过将代表菌株B.velezensisFZB42、B.subtilis168T、B.subtilis3610以及B.amyloliquefaciensDSM7T进行比较基因组学分析发现，B.subtilis168T与B.amyloliquefaciensDSM7T的基因组中参与抗菌化合物合成的基因簇数量远低于B.velezensisFZB42。研究表明，合成bacillomycin D、macrolactin、difficidin、plantazolicin以及orphan nrsA-F等次级代谢基因簇均未在B.subtilis168T和B.amyloliquefaciensDSM7T的基因组中出现。值得注意的是，B.amyloliquefaciensDSM7T及相关B.amyloliquefaciens的代表菌株均缺少由非核糖体合成的抗真菌脂肽(bacillomycin D，fengycin)以及聚酮化合物(difficidin，macrolactin)等次级代谢基因簇，而这些次级代谢基因簇恰恰与促植物生长密切相关。RiPPs(ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides) 是经核糖体合成和翻译后修饰的多肽，主要由N端前体和C端核心区域组成。目前，在B.velezensisFZB42中发现两个具有抑菌活性的RiPPs，分别为：plantazolicin和amylocyclicin，且均未在B.subtilis168T、B.subtilis3610以及B.amyloliquefaciensDSM7T中发现。此外，在B.velezensisFZB42和B.amyloliquefaciensDSM7T的全基因组中还发现抗菌肽Lci。从上述内容可以看出，与B.subtilis168T、B.subtilis3610以及B.amyloliquefaciensDSM7T相比，B.velezensisFZB42在合成次级代谢产物能力方面具有明显的优势[20]。目前，B.velezensisFZB42作为革兰氏阳性根系促生细菌(PGPR，plant growth promoting bacteria)的代表菌株，关于FZB42的综合数据库“AmyloWiki”已成功建成，其收集了迄今为止关于FZB42的所有信息，包括：140多篇关于FZB42的文献报道、相应的功能基因/蛋白质注释、涉及植物-细菌相互作用的基因测序、sRNA基因和翻译后修饰位点预测以及FZB42突变菌株库等。此外，AmyloWiki数据库还与综合报道B.subtilis168的SubtiWiki数据库进行了信息共享，比较B.velezensisFZB42与B.subtilis168的区别，例如：基因，以及与植物病原菌和植物微生物相互作用的拮抗基因，都在AmyloWiki数据库中被重点标注。因此，AmyloWiki数据库的创建为今后B.velezensis次级代谢产物的研究提供更为便利的途径。

在国外，B.velezensis具有良好的潜在市场应用价值，少数菌株已被注册为生物杀菌剂来防治白粉病、灰霉菌、鞘枯病、麦角菌硬粒、晚疫病等植物疾病[27]。Roh等报道B.velezensisRC218的培养液(含菌体)可直接喷洒于农作物的根、叶片等部位来防治害虫和植物真菌疾病[28]。经田间试验证实，B.velezensisRC218能有效降低植物病害严重度和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的积累。通过对这些抑菌化合物的基因簇的检测，发现B.velezensisRC218的生物防控活性可能与菌株分泌脂肽类物质密切相关，例如：surfactin、fengycin、iturin等[29]。通过对B.velezensisBAC03的研究来验证其对疮痂病链霉菌的影响，试验表明BAC03可明显降低疮痂病链霉菌引起的结痂[30]。在国内，B.velezensis9912D于2016年经中华人民共和国农业部批准成为新型生物杀菌剂，最初分离自渤海辽东湾的沉积物样本，其具有较强的植物根际定植能力，并产生多种生物活性物质，特别是抗菌脂肽，在高效防治黄瓜灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病和苹果腐烂病等植物疾病领域具有重要意义。为了工业上的需求，通过化学和物理诱变后，与野生型9912菌株相比，诱变株9912D具有更高的孢子产量和抑制植物病原菌的活性。全基因组测序分析结果显示，在9912D基因组上共发现19个候选基因簇参与次级代谢物的生物合成，包括潜在的新型II lantibiotics[7]B.velezensis不仅在抑制植物病原菌具有重要应用价值，在促进植物生长方面也具有显著功效[31]。研究人员发现，B.velezensis和Bacillusmegaterium(巨大芽孢杆菌)能产生足够的细胞分裂素。经证实，B.velezensis分泌的挥发性有机化合物可通过调节植物生长素的平衡进而促进拟南芥的生长[32]。在温室盆栽混合土条件下测试了B.velezensisBAC03对9种植物的潜在促生长作用。结果表明，菌株BAC03产生的吲哚-3-乙酸、氨和1-氨基环丙烷-1-羧酸盐脱氨酶活性可能与促进植物生长有关[33]。除此之外，B.velezensisFZB42也能够分泌吲哚-3-乙酸(IAA)促进植物生长[34]。在野外和盆栽试验中，接种B.velezensisFZB42对生菜生长及其对根际菌群的影响，研究结果表明，FZB42在生菜生长期间能有效地在生菜根系上定植[35]。

总体来说，B.velezensis具有丰富的次级代谢产物，作为生防菌剂具有突出的表现。然而，B.velezensis在应用推广的实效性仍面临着许多问题。目前，市售的大多数生防菌剂都是基于活的微生物。其中，B.velezensis、B.subtilis、B.pumilus作为主要菌株用于生物杀菌剂的商业化生产[36]，且大多数剂型为稳定的液体悬浮液或由孢子制成的干燥菌粉，主要通过喷洒于种子、土壤以及叶子上达到生物防治效果。然而，制约其商业化推广的关键问题是Bacillus在自然环境中合成的环状脂肽的浓度不足以发挥生物拮抗的作用[37]。且在众多产品中，只有芽孢的数量被明确标出，作为杀菌剂的活性成分，而代谢物(上清液)的浓度却含糊不清，造成生防菌剂对患病植物治疗效果不佳。尽管像ABiTEP公司对浓缩和稳定芽孢杆菌上清液进行了大规模的试验，以达到抑制植物病原菌的效果。但截止到目前，还没有一种商业化生防菌剂可直接利用单一的抗菌代谢物而取得较好的治疗效果。目前，市场上只有少数几种生防菌剂，如用B.velezensisQST713制备的SERENADE○R和用B.velezensisD747制备的Double Nickel 55，均采用活体芽孢和环状脂肽(iturins, fengycin)相结合的联合生物制剂，可能是解决上述问题的突破点[20]。

3 B. velezensis木质纤维素降解酶及基因

B.velezensis可分泌几种纤维素酶和半纤维素酶，来降解植物细胞外壁中的纤维素和半纤维素。酶解的最终产物主要是游离的低聚糖，起到激发植物防御系统的诱导作用和参与菌株在植物根系定植。近年来，Kim等[2]报道发现B.velezensisGH1-13基因组上拥有一系列能够有效地对植物根系进行定植的基因，分别为：xylanase(xynA和xynD)、glucanase (bglC和bglS)、galactose (ganA-lacR)等。在B.velezensisFZB42的全基因组也发现了能够利用植物细胞壁中的纤维素和半纤维素的酶基因，包括：endo-1,4-β-glucanase、endo-1,4-β-xylanase、1,4-β-xylan xylosidase[4,41-44]。此外，在B.velezensisLS69[6]、B.velezensisUCMB5113[45]、B.velezensis157[46]以及B.velezensisZY-1-1[47]的全基因组也发现参与降解植物细胞壁的相关酶基因。目前，B.velezensis编码的胞外水解酶主要包括：淀粉酶amyE、内切葡聚糖酶eglS以及木聚糖酶xynA，这些酶类在“B.amyloliquefaciensoperationalgroup”植物相关代表菌株中均有发现，而在土壤相关的代表菌株，例如B.amyloliquefaciensDSM7T并未发现[48]。此外，涉及木聚糖降解的操纵子基因(xylA, xynP, xynB, xylR) 在B.subtilis168和B.velezensisFZB42的全基因组均有发现，并未在B.amyloliquefaciensDSM7T中发现，表明B.subtilis168和B.velezensisFZB42在一些涉及植物高分子降解的基因上具有共同之处。

在此基础上，Chen等[49]通过比较基因组学分析了24株B.velezensis全基因组中共有或特有的木质纤维素酶基因，证实其对纤维素和半纤维素具有潜在的降解能力，并提出B.velezensis很可能是一种被忽视和未开发的降解木质纤维素的新型菌种资源。在24株B.velezensis比较基因组分析中，存在众多共有的木质纤维素酶基因。如表1所示，参与纤维素降解的共有基因主要包括：GH5 (endo-1,4-β-glucanase)、GH30(glucan endo-1,6-β-glucosidase)、GH4(6-phospho-β-glucosidase, 6-phospho-α-glucosidase)、GH1 (6-phospho-β-galactosidase)、GH16(β-glucanase)。经分析发现24株B.velezensis均缺少外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase)，因此不能直接水解纤维素[50]。涉及半纤维素降解的共有基因包括：GH11 (endo-1,4-β-xylanase)、GH43 (arabinan endo-1,5-α-L-arabinosidase, arabinoxylan arabinofuranohydrolase)、GH51 (α-N-arabinofuranosidase)、GH30(glucuronoxylanase)。此外，24株B.velezensis具有较多共同的碳水化合物酯酶(CE)也参与木聚糖降解，主要作用于木聚糖和低聚木糖的脱乙酰作用。包括： CE3(acetyl xylan esterase)和CE 7 (acetylxylan esterase)。因此，猜测B.velezensis具有编码降解半纤维素的关键酶基因，在食品、动物饲料、纺织、造纸、生物燃料等行业，以及木糖生产中可能具有潜在的应用价值。除此之外，所有24株B.velezensis还具有涉及降解蔗糖(sucrose-6-phosphate hydrolase，levanase)、甘露聚糖(β-mannosidase)以及果胶(pectate lyase)的共有酶基因。从24株B.velezensis比较基因组中利用木质素的能力可以看出，所有B.velezensis涉及辅助酶类家族(AA)中的成员较少，仅发现了AA4, AA6, AA7以及AA10。因此，B.velezensis对木质素的降解能力有限，需要一定的预处理方法协助去除木质纤维素底物中的木质素成分。综上所述，结合24株B.velezensis的dbCAN和CAZY数据库以及菌株间比较基因组分析，表明B.velezensis具有利用纤维素和半纤维素的潜能，而缺乏利用木质素的能力。因此，将B.velezensis用于处理木质素含量低的农业废弃物和农副产品，利用固态发酵方式处理纤维素和半纤维素成分，获得高价值的代谢产品(酶、抗生素类)，有望成为B.velezensis在木质纤维素利用方面的新方向。

表1 24株B. velezensis纤维素和半纤维素降解的共有酶基因Table 1 Annotated common genes encoding lignocellulose-degrading enzymes of 24 B. velezensis strains mainly on cellulose and hemicelluloses

注：所有B.velezensis基因组序列来源于GenBank DNA数据库(2017.12)

Note：Genomes ofB.velezensisused in the study were accessed from the GenBank DNA database(2017.12)

4 展 望

目前，B.velezensis菌株被广泛应用于生物防治领域取代农药来提高农作物的产量，并解决杀虫剂对农业生态系统造成的环境污染。然而，有关B.velezensis在脱色脱毒方面的应用报道较少。仅Bafana等[51]报道B.velezensisAB具有对偶氮染料Direct Red 28 (DR28)的脱色能力，经研究发现其具有偶氮还原酶(60 kDa)和染料解毒活性。B.velezensisAB可将DR28降解为联苯胺和4-氨基联苯，二者均为强诱变剂。不仅如此，这两种化合物均可在短时间内被B.velezensisAB进一步降解，从而降低了染料的毒性和诱变性。此外，在2018年最新的研究报道中，wang等[52]报道了将B.velezensisA2作为饲料添加剂，能够有效去除饲料中的霉菌毒素-玉米黄酮(Zearalenone，ZEN)污染，保护小鼠免受ZEN的毒性损伤，尤其对急性肾损伤具有保护作用。Shu等分离的B.velezensisDY3108，其胞外上清液对黄曲霉毒素B1(AFB1)的降解活性可达91.5%，高于Xia等[53]报道的Bacillus subtilis JSW-1，其无细胞上清液可降解67.2%的AFB1。与此同时，B.velezensisDY3108除较高的AFB1降解活性之外，其上清液还具有良好的耐pH性和热稳定性。相关文献也报道了能够对霉菌毒素脱毒的芽孢杆菌还包括：Bacillussubtilis[54],Bacilluslicheniformis[55]以及Bacillusamyloliquefaciens[56]。但截至到目前，这些微生物的霉菌毒素代谢途径及相关组成成分尚不清楚，限制了其对食品和饲料生产中霉菌毒素解毒机制的研究，有待于更多的科研工作去揭示。但不可否认，B.velezensis在霉菌毒素解毒和饲料基质生物修复方面具有广阔的应用前景。此外，结合B.velezensis能够分泌纤维素酶和半纤维素酶的能力，是否有望成为动物饲料酶制剂，来提高动物饲料消化率以及生产性能，仍需进行更加深入而具体的研究。