深县猪mtDNA CytB基因的遗传多样性与母系起源研究

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(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000；2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000；3.河北省山区农业工程技术研究中心，河北 保定071000)

20世纪80年代后，随着大量外国瘦肉型猪品种的引进，我国地方猪群体规模急剧下降，品种数量不断减少。比较1988年出版的《猪品种志》[1]和2010年出版的《中国畜禽遗传资源志-猪志》[2]各地方品种群体规模的变化，大部分地方猪群体规模急剧下降。尽管近年来在优质特色产品的市场需求推动下，各地的地方猪都有较大程度的恢复，但这些群体都不可避免地受到瓶颈效应的影响。开展遗传多样性研究，是对这些群体进行有效保护和合理开发利用不可缺少的基础性工作。

深县猪原产于深县，主要分布在黑龙港流域，是黄淮海黑猪的一个地方类群。深县猪是当地劳动人民经过多年选育而成的地方良种猪，确切的形成无从稽考。据1978～1982年统计，深县猪的群体规模有8万余头，占黄淮海黑猪40多万头的约18%[1]。但由于无计划地引进国外品种猪，再加上市场广泛引领作用下，纯种的深县猪逐步被淘汰。在多方努力下，通过搜集整理、提纯复壮，到2014年，深县猪的基础母猪恢复到250余头，次年通过了国家畜禽遗传资源委员会品种认定，是一个典型的经历过瓶颈期的品种。

群体遗传多样性标志着群体的可持续发展潜力，群体间遗传多样性的相似程度可以反映出群体间的起源联系。线粒体DNA呈母系遗传，其多样性反映母系群体特征。线粒体基因组被认为是按照自身的进化速率发展的小型基因组，有效种群数量是核基因标记有效种群数量的1/4，分析较少的样本量就可代表一个种群，具有分子结构简单、进化速度快和易于测序及分析等特点，被广泛地用于系统发生和群体进化研究的标记[3]。线粒体基因组中共有37基因，在编码蛋白的13个基因中，ND1、ND4、ND5、Cytb和COI为进化速度较快的5个基因，其中以Cytb基因的应用最为普遍。Gupta等[9]实验证明，Cytb基因中421 bp片段的DNA序列可以对印度野猪和家猪这两个亚种进行区分。通过对NJ树的分析表明印度家猪不是印度野猪的后代，却与欧洲和亚洲野猪有99%的相似度，这也与家猪的欧亚起源观点相符。王继英等[4]利用mtDNA CytB基因为标记，从分子水平探讨 12 个猪种 166 个样本(8 个山东省猪种，3个引进猪种和梅山猪种)的遗传多样性和各猪种间的亲缘关系，研究结果表明山东猪种有共同的母系祖先，品种内母系遗传多样性较贫乏CytB基因进化速率虽不及D-Loop区快，但一个较小的基因片段可包含从种内到种间乃至到科间的进化遗传信息,被广泛认为是研究近缘物种间和种内系统进化、遗传分化程度和遗传结构等的重要指标。

胡英欣等[4]用7个微卫星位点对深县猪5个家系、70个种猪个体进行测定，检测了深县猪群体的遗传多样性，分析了该群体各公猪家系之间的遗传距离。赵思思等[5]利用8个微卫星标记对深县猪40个种猪个体的遗传多样性进行了研究。但从线粒体基因组水平探究深县猪遗传多样性的报道较少，目前为止，利用线粒体基因组中CytB基因对深县猪的分子进化方面的研究尚属空白。

本研究以深县猪为研究对象，对mtDNACytB基因全序列进行PCR扩增和序列测定，借以了解深县猪猪种的遗传资源状况并阐明与其它猪种的亲缘关系，可为该品种的有效保护及合理开发利用提供依据，同时对其它经历过瓶颈期的类似地方品种遗传变异研究具有借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料与DNA提取

试验样品采自辛集市某牧业有限公司，随机采集深县猪40头猪只的耳组织样，置于装有1 mL 75%乙醇的EP管中带回实验室，-20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

Wizard基因组DNA纯化试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；dNTP、Takara TaqTM Hot start Version购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据Genbank公布的猪mtDNA CytB基因的序列(序列号：AB015081.1)，应用PCR引物设计的一般原则，使用Primer5.0软件设计引物：上游引物：5'-ACCACGACCAATGAC-3'，下游引物:5'-CAGGGAATAGTTTAGTTAG-3',引物由北京华大基因研究中心合成。

1.4 PCR扩增与测序

深县猪耳组织DNA参照基因组提取试剂盒说明书进行。PCR反应体系为：10×Buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL ，10 mM上下游引物0.5 μL，DNA模板1.25 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，加双蒸水至25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳纯度检测合格后送北京华大基因研究中心进行双向测序。

1.5 数据分析

测序结果用SeqMan软件处理得mtDNACytB基因全序列，应用Bioedit软件对测定的40头猪样本CytB基因全序列进行比对分析，对比结果使用Dnasp5.0软件计算单倍型数(number of haplotypes，h)、单倍型多样性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多样性(nucleotide diversity，Pi)、平均核苷酸差异数(the average number of nucleotide difference，k)等。利用 MEGA3.1软件统计序列的平均碱基组成、多态位点数、简约信息位点数等。

下载GenBank已公布的14个猪种mtDNACytB基因全序列(见表4)进行比对，利用MEGA5.0软件应用邻接法(NJ)构建了深县猪、部分地方猪种和引进猪种的CytB基因序列分子系统发育树，各分支上的数字表示用1000次Bootstrap统计分析后对该支的支持百分比。

2 结果与分析

2.1 深县猪mtDNA CytB基因目的片段的扩增

从图1可见，产物条带清晰，与预期的产物片段大小一致，且特异性良好，可用于后续测序分析。

2.2 PCR产物测序结果

对mtDNACytB基因片段扩增产物进行测序，获得40个样本的扩增序列，去除引物序列和两端不准确区域，有效序列全长1 140 bp，见图2。由图2可见，所测得序列波峰突出，无杂峰，说明深县猪mtDNACytB基因全序列得到有效扩增。

2.3 深县猪mtDNA CytB基因全序列的多态性

所测40个深县猪个体长1 140 bp的mtDNACytB基因全序列结果显示，A、T、G、C的含量分别为25.93%、31.72%、28.90%及13.45%，其中A+T的含量(57.65%)高于G+C的含量(42.35%)。在1 140 bp长的序列中共发现2个变异位点，无插入和缺失突变，全部为转换位点，其中简约信息位点2个，未发现单一信息位点。

40条序列共定义了3种单倍型，见表1。单倍型多样性(HD)为0.312，核苷酸多样性(Pi)为0.00026，平均核苷酸差异数(K)为0.327。用Tajima's D值(-0.05169)进行中性检验，经检验不显著(P>0.10)，符合中性突变。

2.4 基于CytB基因全序列的系统进化树

利用MEGA5.0软件应用邻接法(NJ)构建了深县猪、部分地方猪种和引进猪种的CytB基因序列分子系统发育树。从图3中可以看出，所构建的NJ系统树分为两大支：第一支主要以地方猪种为主，与大白猪聚为一类；第二支为引进猪种,将杜洛克、汉普夏猪、长白猪聚为一类。其中深县猪的三种单倍型聚集在同一分支，与莱芜猪、大蒲脸猪遗传距离较近。

表1 Cytb基因各单倍型变异位点信息表Table 1 Cytb gene haplotype variation site information table

图3基于CytB基因全序列构建的NJ分子系统树
Fig.3 NJ Molecular phylogenetic trees of pigs based on the complete sequences ofCytBgene

3 讨 论

3.1 CytB基因全序列的变异和多态性分析

单倍型多样性(HD)值、核苷酸多样性(Pi)值和平均核苷酸差异数(k)是衡量一个品种(群体)mtDNA变异程度的重要指标。单倍型多样性值和核苷酸多样性值越小，群体的多态程度越低，遗传多样性越贫乏[6,16]。通过对40条CytB基因全序列分析表明，A+T的含量(57.65%)明显高于G+C的含量(42.35%)，说明深县猪mtDNACytB基因全序列富含A+T，能被RNA聚合酶等特异分子识别而作为转录的起始序列，表现出深县猪碱基组成的偏倚性，这符合mtDNA的进化特点[7]。本研究结果显示，深县猪群体的单倍型多样性为0.312，而核苷酸多样性为0.00026，群体遗传多样性呈现出单倍型多样性高、核苷酸多样性低的特点。这种“高单倍型多样性、低核苷酸多样性”的现象在其他物种中同样存在，其主要原因可能是一个较小的有效祖先种群经历了近期的种群数量扩张[21]。

与国内地方猪种进行对比，单倍型多样性指数(0.312)低于大河乌猪[11](0.9932)和沂蒙黑猪[4](0.5142)；核苷酸多样性指数(0.00026)低于大河乌猪(0.0113)和沂蒙黑猪(0.00045)。以上结果表明该深县猪群体母系遗传多样性较为贫乏。本实验室前期对深县猪D-loop区遗传多样性进行研究，结果与之相同。

由于该品种是抢救性挖掘、搜集恢复的群体，世代平均近交率取决于有效规模最小的世代的群体规模，即产生“瓶颈效应”。深县猪的这种瓶颈效应的打击加上随后不可避免的近亲繁殖造成了遗传多样性的贫乏。群体遗传学证明，若不存在选择、迁移的影响，近交与遗传漂变是导致基因丢失的主要原因。一般情况下，小群体基因更容易发生遗传漂变，这种波动变化导致某些等位基因的消失，另一些等位基因的固定，从而改变了群体的遗传结构。而小群体经过多代的繁衍，若不做好血统关系的记录和在选配、留种中注意家系血统得保持，近交会造成多样性的降低，加上遗传漂变作用的影响，遗传多样性会降低。现存的深县猪群体保种规模均较小，在保种过程中只注重公猪血统的更新，导致母系遗传多样性贫乏，也导致了群体遗传多样性的来源较为狭窄。

3.2 基于CytB基因全序列遗传分析的母系血统

在人类对猪种的干预中，通过不同地区的猪种间相互杂交，使其发生基因(核苷酸)交流是一个重要的方面。由于猪在杂交繁育中发生了基因的交流，其后代在染色体上插入或缺失了某些核苷酸序列和片段，因此产生了新的核苷酸序列或片段，从而在表型上产生各种变异[12]。在深县猪mtDNACytB基因全序列NJ进化树中，深县猪三种单倍型聚为同一分支，母系来源单一，与莱芜猪、大蒲莲猪等山东品种遗传距离较近。中国家猪起源中心存在两个理论：北方家猪品系起源于北方野猪，南方家猪品系则起源于南方野猪，即南北方起源中心论；中国家猪分别由长江流域和中国南方野猪驯化而来。深县猪与莱芜黑猪、大蒲莲猪同属于黄淮海黑猪，生长地区的生态条件基本相似，农作制度、饲料种类、养猪方式类同，随着生产的发展，相邻地区之间的猪品种不断发生血缘交流，各地猪种血统上有相互影响。初步推断，深县猪起源可能与山东省的莱芜黑猪、大蒲莲猪有关，而山东省的黑猪则有可能是以湖北及安徽等地的华中型猪种为母本，随人口向北迁徙经长期驯化，选育而形成华北型黑猪，这些以莱芜猪，大蒲莲猪为代表的华北型黑猪可能在近代，由山东进入河北，在一定程度上影响了深县猪的形成。本研究仅从Cytb基因来研究深县猪群体的遗传结构还不够全面，今后应综合利用核内核外各种分子标记进行综合研究，对其起源进行更全面的追溯。

3.3 基于恢复群体遗传特征的地方猪群体保护

本试验中的深县猪群体为企业集中饲养，群体由少量搜集群体逐渐扩群繁育而成，血统有限，遗传基础相对狭窄，加上猪是多胎动物，容易受到血缘的限制[22]。现今尚存的黄淮海黑猪存在着个体少、育种群体小、血缘稀缺的困境，大部分黄淮海黑猪只有4～6 个血缘, 处于一种濒危状态, 也给遗传多样性带来了极大的局限, 对选种不利。针对这种恢复群体遗传特征由群体血统狭窄造成的群体多样性较低的现象，建议加大选育和保护力度，进行合理选配和血统分离，创建更多家系，建立种群的遗传谱系从而避免种群内的近亲繁殖，增加稀有基因个体的繁殖机会防止稀有基因由于遗传漂变而在种群中消失，并根据保种需要和市场需求，适度扩大群体规模。