低磷胁迫下内生真菌对宿主杉木幼苗生理生化的影响

艾如波，徐彩瑶，吴承祯,4，李 键，林 晗，谢安强*

(1.福建农林大学 林学院，福建 福州 350002； 2.福建省高校 森林生态系统经营与过程重点实验室，福建 福州 350002； 3.南京大学 地理与海洋科学学院，江苏 南京 210023； 4.武夷学院，福建 南平 354300)

磷是植物生长发育所需的重要元素之一，是植物主要有机分子的关键部分(如蛋白质、核酸、膜磷脂、ADP、ATP和NADP等)，在植物的新陈代谢中发挥关键作用，同时也影响作物的品质和产量[1-2]。相关研究表明，在大多数土壤中，由于Ca、Fe和Al化合物以及粘粒的大量存在，土壤磷的活性很低；又因活性磷在土壤中易被固定，植物对磷肥的利用率亦极低。因此，土壤中可供植物吸收利用的有效磷缺失，大量磷不能供植物体利用，造成植物“遗传学缺磷”(指维持植物体自身生长和能够进行亲代遗传所需要的磷元素含量缺失)，而不是“土壤学缺磷”(指植物正常生长，需要通过根部吸收来自土壤中的必需磷元素)。植物磷高效利用的研究主要有形态学、生理学以及遗传学3种机制[5-8]。

植物内生真菌是指生活于不同健康植物体的各种组织和器官中，同时与宿主植物体互利共生达到减少宿主病害、减产等作用的微生物。可通过传统的形态学和现代分子生物学进行鉴定和确定其内生性。内生真菌主要是由子囊菌及其无性型组成，也包括少数担子菌和接合菌[10]。CARROLL[11]定义内生菌为生活在地上部分，在植物体内未能引起明显病害症状的真菌。内生菌包括内生真菌(Endophytic fungi)和内生细菌(Endophytic bacteria)。内生真菌多样性研究表明，植物内生菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中，分布广，种类多，目前已对松属[12-14]、桤木属[12]、桉属[15-16]、冬青栎属[17]、山毛榉属[18]、红豆杉属[19]等进行广泛的研究。内生真菌的研究主要集中在两方面，一是来自于植物体作为宿主本身的影响，二是对植物内生真菌次生代谢产物的研究[20]。研究表明，感染有益内生菌的植物宿主往往具有生长迅速、抗胁迫、抗干旱、抗高温等优势。

杉木是中国南方最常见的经济造林树种，以存活率高、造林率高、造材率高、成本低在森林经营上受到普遍欢迎，其成林面积和储蓄量居我国人工林首位[21]。但作为我国特有的速生商品材树种，杉木在持续性经营过程中出现了许多问题，如林分生长力下降、林地土壤肥力下降、病虫害加剧、生物多样性降低等[22]。获得对杉木提高抗逆性及促进生长发育作用的内生真菌菌株是实现杉木可持续经营的一种新途径。为此，笔者等以低磷胁迫下的杉木为研究对象，通过试验分析不同内生真菌下杉木植株的叶片电导率、丙二醛、超氧化物歧化酶和可溶性蛋白含量，分析在低磷胁迫下内生真菌对杉木生理特征的影响，探明内生真菌与杉木植物互作后提高其抗逆性和促进生长的效果，为生产应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于福建农林大学福建省高校森林生态系统过程与经营重点田间实验室。东经118°08′～120°31′，北纬25°15′～26°39′，属典型的亚热带季风气候，气温适宜，温暖湿润，夏长冬短，无霜期达326 d。年平均日照数为1 700～1 980 h；年平均降水量为900～2 100 mm；年平均气温为20～25℃，最冷月1—2月，平均气温6～10℃；最热月7—8月，平均气温33.7℃。极端气温最高42.3℃，最低-2.5℃。年相对湿度约77%。

1.2 试验材料

杉木幼苗：1年生杉木组培苗，由福建省林科院提供。

菌株：无柄盘菌属Peziculasp.(NG1)，毛霉属Mucorsp.(CG5)，拟青霉属Paecilomycessp.(AJ6)，丝葚霉属Papulosporasp.(AJ14)，青霉属Penicilliumsp.(AJ13)，均筛选自成年老龄杉木，其中，菌株AJ6已获国家发明专利(专利名称：1株能促进杉木磷吸收的内生真菌，保藏编号：No.9186)，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 试验采用土培盆栽试验。选择长势一致的苗木定植于直径15 cm、高10 cm的塑料盆中，每盆放入经高压灭菌的黄心土约3 kg。经过2个月的恢复性生长后开始接种试验。将制备的等浓度100 mL菌液(5个菌液)连续3 d分别从植物顶端施浇，确保其根、茎、叶及土壤中均有菌液，设置5个重复，以水溶液为空白对照。接种15 d后进行低磷胁迫处理。

1.3.2 菌液制备 使用马铃薯葡萄糖水培养基(PDB)，在50 mL的液体培养基中接入供试菌株，然后经过恒温振荡培养箱培养72 h。按10倍稀释法使用无菌生理盐水稀释菌液，通过在显微镜下观察血球计数板计算并配制成浓度为5.5×106cfu/mL的菌液。

1.3.3 低磷胁迫设计 通过施氮肥、钾肥及其他微量元素确保变量唯一，低磷胁迫采用KH2PO4。试验设计4个磷处理水平，正常条件磷含量为48 mg/kg、轻度胁迫磷含量为24 mg/kg、中度胁迫磷含量为12 mg/kg、重度胁迫磷含量为0 mg/kg，各处理5个重复。盆栽基质土壤为黄心土，经测定其pH为4.50、有机质21.82 mg/g、全氮0.32 mg/g、水解氮0.11 mg/g、全磷0.40 mg/g、有效磷0.004 1 mg/g、全钾12.47 mg/g、速效钾0.03 mg/g。

1.3.4 电导率测定 电导率测定参考陈爱葵等[23]的方法进行。经自来水冲洗干净的叶片用蒸馏水冲洗3次，并用滤纸吸干残留的水分。快速称取鲜样0.1 g放在具塞试管中，加入10 mL去离子水，浸提24 h后，摇匀，用电导仪测定浸泡液的电导率(A1)。然后放入100℃沸水浴中30 min，以杀死植物组织，取出后冷却至室温后摇匀，测得煮沸电导率(A2)。以相对电导率表示细胞膜透性的大小。

相对电导率=A1/A2×100%

1.3.5 植物生理指标测定 丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及可溶性蛋白含量均参照王学奎[24]的方法进行测定。

1.4 数据处理

数据整理与初步处理采用Excel 2003，作图采用Origin8.0，数据的统计分析采用Spss18.0。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗相对电导率的影响

植物膜系统状况的良好反应以相对电导率来作为重要参照，植株受到干扰或侵害下主要发生质膜破损，膜蛋白变性失活导致质膜伤害、胞液外渗而使相对电导率增大，此现象比较直观，是一个具实际性的数据[23]，同时能够衡量植物细胞组织的幼嫩程度和确定细胞质膜受伤害的程度[25]。从图1可知，正常条件下，接种不同菌株幼苗的叶片相对电导率多数呈上升趋势，其中，接种菌株NG1幼苗的相对电导率则先降后升；在该条件下，菌株NG1、AJ6和AJ14作用下幼苗的相对电导率比对照低。轻度胁迫条件下，各处理的相对电导率呈上升趋势，其中，接种AJ14菌株的杉木幼苗叶片相对电导率较对照低。中度胁迫条件下，各处理叶片相对电导率多数呈上升趋势，且在胁迫中期(30～45 d，下同)，除接种CG5菌株外，其余接种内生真菌幼苗的相对电导率比对照低，当胁迫至60 d时均比对照高。重度胁迫条件下，各处理的叶片相对电导率均呈上下波动趋势。其中，接种NG1和AJ13菌株的幼苗叶片相对电导率变化趋势相近，且变化幅度较大，呈先升后降再略微回升的趋势；而接种CG5菌株幼苗叶片相对电导率和对照的变化趋势类似，在数值上也相近；接种AJ6和AJ14菌株的幼苗叶片相对电导率均比对照低，且接种AJ14菌株的幼苗叶片相对电导率在整个胁迫期间都低于对照。从整体上看，不同胁迫梯度条件以及不同胁迫动态下，各处理幼苗叶片相对电导率的值均为0.2%～0.5%。

总体看，正常条件下，菌株NG1、AJ6和AJ14能够有效缓解低磷胁迫的危害；轻度胁迫条件下，菌株AJ14能较好地保护植株生长；中度胁迫条件下，各菌株在胁迫前中期(15～45 d，下同)均能显著缓解低磷胁迫；重度胁迫条件下，菌株AJ6和AJ14表现良好，能有效缓解逆境对植株的伤害。

2.2 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗超氧化物歧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)是一种源于植株体的活性物质，在活性氧的清除、控制膜脂过氧化水平及减轻膜的伤害上起重要作用[26]，外部环境条件能影响超氧化物歧化酶的活性水平，植物在逆境下受到的伤害以及植物对逆境抵抗能力往往与体内的超氧化物歧化酶的活性水平有关[27]。由图2可知，正常条件下，接种不同内生真菌的杉木幼苗叶片SOD活性的变化趋势不一致；其中，对照的幼苗叶片SOD活性稳定在335～345 U/g，接种CG5菌株的幼苗叶片SOD活性在整个胁迫期间均比对照高，而接种AJ14菌株的幼苗叶片SOD活性除胁迫初期(15 d)比对照低之外其余胁迫时期均比对照高。轻度胁迫条件下，对照的幼苗叶片SOD活性呈先上升后下降的变化趋势；接种内生真菌的幼苗叶片SOD活性的变化趋势总体而言比较稳定，除接种菌株NG1幼苗的SOD活性在初期较低外，其余处理的叶片SOD活性都比对照高。中度胁迫条件下，各处理的SOD活性的动态变化曲线比较集中，接种AJ6和NG1的幼苗SOD活性出现较大波动，分别为先下降后略微上升和先小幅度下降后逐渐上升的变化趋势；至胁迫60 d时，各处理幼苗叶片SOD活性很相近，且都比对照大，接种菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14、AJ13幼苗的SOD活性分别比对照活性高23.48%、23.80%、24.25%、20.78%和19.32%。重度胁迫条件下，对照的幼苗叶片SOD活性的变化趋势为先略微上升后下降，接种菌株处理的幼苗叶片SOD活性，除接种AJ6菌株幼苗的活性呈先降后升外，其余菌株均为先略微上升后下降再上升的变化趋势；至胁迫60 d时，接种菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14和AJ13幼苗的SOD活性分别比对照高28.44%、28.80%、28.51%、23.65%和30.09%。

综上所述，与对照相比，菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14及AJ13都可以显著提高杉木幼苗叶片的SOD活性，对杉木幼苗均有一定的缓解低磷胁迫的作用，但不同菌株发挥作用的时间和强度不同。

2.3 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗丙二醛的影响

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的产物，一个作为衡量氧化膜脂程度大小的重要指标。所以，通过研究植株体内丙二醛含量的动态性变化能够知晓其反映该树种抗逆性能力的大小[28]。从图3可知，正常条件和重度胁迫梯度条件下，随着胁迫时间的延长，对照幼苗叶片的MDA含量呈先增后减趋势，轻度胁迫和中度胁迫条件下，随着胁迫时间的延长，对照幼苗叶片的MDA含量呈逐渐减少趋势，接种内生真菌处理杉木幼苗的MDA含量总体呈缓慢增加，到60 d时，接种内生真菌杉木幼苗叶片的MDA含量显著高于对照。综上所述，不同低磷胁迫梯度下，接种不同内生真菌幼苗的叶片MDA含量在胁迫15 d、30 d、45 d内都比对照低，至胁迫60 d时都比对照高。从叶片MDA含量的角度分析，在胁迫中前期，接种不同内生真菌植株的MDA含量的差异并不明显，且变化幅度不大。

2.4 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗可溶性蛋白的影响

可溶性蛋白是一种为植物体提供营养的物质，其含量高低与植物抗逆性有直接的关系[29]。从图4可知，对照在不同梯度胁迫下随着胁迫时间的推移，杉木幼苗可溶性蛋白均呈先降后升趋势。同时，各胁迫梯度的胁迫初期，对照幼苗可溶性蛋白含量均比其他处理高。随着胁迫时间的延长，不同胁迫处理的各接种菌株处理幼苗的叶片可溶性蛋白含量呈先升后降趋势。在不同胁迫梯度下，各接种菌株幼苗因接种菌株的可溶性蛋白含量动态变化不同。正常条件下，各处理幼苗在胁迫45 d，可溶性蛋白含量比对照高，在胁迫中后期(30～60 d，下同)接种菌株NG1和AJ13的幼苗叶片可溶性蛋白含量在整个中后期都比对照高。轻度胁迫条件下，接种菌株AJ6、AJ14和AJ13的幼苗叶片可溶性蛋白含量在整个胁迫中后期都比对照高。中度胁迫条件下，接种菌株AJ6、AJ14的幼苗在整个中后期表现较好。重度胁迫条件下，接种菌株NG1、AJ6、AJ14和AJ13的幼苗在整个胁迫中后期叶片可溶性蛋白含量都比对照高。

综上可知，接种菌株不能在各胁迫梯度的整个胁迫动态期间都发挥促进植物生长的作用。不同菌株作用下幼苗的可溶性蛋白含量在不同胁迫梯度中的动态变化均大致呈先升后降趋势。菌株AJ6和AJ14在低磷胁迫下能有效提高杉木幼苗的可溶性蛋白含量。

3 结论与讨论

生理特性通过测定植物细胞渗透物质和抗氧化物酶活性等指标来分析。膜透性的增大是膜系统被破坏的表现之一，膜透性的大小可用电解质渗漏率即电导率的变化来衡量[30]。叶片相对电导率在正常条件下，菌株NG1、AJ6和AJ14能有效缓解低磷胁迫的危害。轻度胁迫条件下，菌株AJ14能较好地保护植株生长；中度胁迫条件下，各菌株在胁迫中前期均能显著缓解磷胁迫；重度胁迫条件下，菌株AJ6和AJ14表现良好，能有效缓解逆境对植株的伤害。丙二醛(MDA)含量是衡量膜脂过氧化程度的一个非常重要的生理指标，在不同胁迫梯度下，5株溶磷菌均能在胁迫15～45 d显著缓解低磷环境对植株的危害，胁迫至60 d时，MDA含量均比对照高。超氧化物歧化酶SOD是源于生物体的一种活性物质，能够催化超氧化物离子生成O2和H2O2，作为广泛分布于各生命体内的抗氧化物酶和主要清除生物体内自由基的物质，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线[30]。同时在外部能够衡量并影响着超氧化物歧化酶的活性水平，植物受逆境伤害下可以知道植物对逆境抵抗能力往往与体内的超氧化物歧化酶的活性水平有关[27]。与对照相比，菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14和AJ13都可显著提高SOD活性，对杉木幼苗均有一定的抵御低磷胁迫的作用，以菌株AJ14效果最佳。可溶性蛋白积极参与细胞渗透压的调节。在抗逆性环境下，迫使植物体内的一些基因关闭，诱导一些能够拮抗逆境的基因表达，导致正常蛋白合成受阻[31]，通过调节可溶性蛋白等渗透调节物质的含量来提高植物的耐低磷性[32]。接种菌株不能在各胁迫梯度的整个胁迫动态期间都发挥促进植物生长的作用。不同菌株作用下幼苗的可溶性蛋白含量在不同胁迫梯度中的动态变化大致都呈先升后降的趋势。通过分析比较，菌株AJ6和AJ14在低磷胁迫下能有效提高杉木幼苗的可溶性蛋白含量。

研究在菌液的配制上，仅探索了单一菌株对杉木幼苗的影响，在今后的研究中将开展混合菌对杉木生长发育的影响；在低磷胁迫梯度上，仅设置4个胁迫梯度，还存在一定的局限性，未能更好更全面地体现杉木对磷胁迫完整的响应机制。由于时间的限制，试验仅研究了内生真菌-杉木共生体的各种特性，对各种响应机制的深层次原因未涉及，对植株有显著促进作用的菌株，后续可开展对其次生代谢物质及分子水平等相关领域的研究。