半伏小薄孔菌Antrodiella Semisupina次级代谢产物研究

邓张双 施亚群 刘秀继 杜维力 郭志勇 李 啸 余贤军 陈 晖

(1.三峡大学 生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司研发中心， 湖北 宜昌 443003；3.湖北医药学院基础医学院， 湖北 十堰 442000)

微生物合成的含氯化合物具有重要的生理功能[1]，是新药候选药物的重要来源之一，如分离于放线菌Salinispora tropica的含氯次级代谢产物Salinosporamide A是一种潜在的蛋白酶抑制剂[2]，对很多肿瘤细胞具有非常强的抑制活性.作为“寡营养、高盐”的海洋生态系统，胁迫微生物产生耐盐或嗜盐的生理特性，因此，海洋来源的微生物是生产含氯化合物的主要源泉[3].

陆生微生物生产含氯化合物的研究鲜有报道[4].课题组从南京紫金山林区中的腐木上分离鉴定一株多孔菌半伏小薄孔Antrodiella semisupina[5]，该菌经土豆液体发酵，乙酸乙酯富集代谢产物，浸膏采用柱层析分离，得到5个次级代谢产物1-5，其中包括3个含氯化合物1-3，1，2和4均为首次从陆生真菌中分离.本文详细报道了化合物1-5的分离、鉴定及抗肿瘤活性评价.

图1 半伏小薄孔菌A.semisupina发酵液中次级代谢产物1-5化学结构式及高效液相色谱图

分析条件：高效液相色谱仪为Dionex Ultimate 3000；色谱柱为YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100 Å，4.6×250 mm；流动相为甲醇-0.1%冰醋酸水溶液，30 min 10～100%梯度洗脱；流速为1 m L/min；检测波长为254 nm；进样量为5μL.

1 仪器与材料

核磁共振谱在Bruker-ARX-400核磁共振谱仪上测定，内标为TMS；化合物HRMS在Thermofisher EI质谱仪上测定；化合物纯化和纯度分析分别在Waters 1525EF和Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪上进行，分析型色谱柱为YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100Å，4.6×250 mm，制备型色谱柱为YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100Å，10×250 mm.

柱层析硅胶(200～300目)、薄层层析硅胶板(200 mm×200 mm)均购自青岛海洋化工厂；凝胶填料为Sephadex LH-20.

半伏小薄孔菌(A.semisupina)保存于三峡大学生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室.

2 提取与分离

真菌Antrodiella semisupina采用PDB土豆液体培养基(5 L)室温震荡培养30 d，纱布过滤得到发酵培养菌液，减压浓缩后的菌液依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯分别室温萃取3次，浓缩后分别得到浸膏12 mg、300.6 mg.乙酸乙酯部位经Sephadex LH-20柱层析分离，合并相同组分，最终得到4个片段.片段3(156mg)经硅胶柱分离，氯仿/甲醇(v/v100∶1，100∶2和0∶100)洗脱，TLC及HPLC-DAD分析，合并相同组分，最终得到3个片段.片段2(78 mg)经制备型HPLC分离纯化，分别得到化合物1(2.7 mg)，2(3.3 mg)，3(6.8 mg)，4(6.1 mg)和5(3.1 mg).

3 活性鉴定

采用RPMI-1640或DMEM(Gibco，Invitrogen，USA)培养基培养MDA-MB-231细胞，加入10%胎牛血清(FBS，HyClone，USA)，培养条件为37℃，5%CO2.用不同浓度的GEA处理细胞48 h，用Automated Microplated Reader(Bio-Tek，VT，USA)在570 nm测量吸光度，抑制率计算为：抑制率(%)=(对照组的平均A570-实验组的平均A570)/(对照组的平均A570-空白组的平均A570)×100%.

4 结构鉴定

化合物1为白色不定型粉末.EI-MS m/z 216.14[M]+和218.15[M+2]+显示的分子离子峰暗示化合物1含有氯原子.结合NMR数据，推测化合物分子式为C10H13ClO3.氢谱显示化合物含有一个双峰甲基[δH 1.08(3H，d，J=6.4 Hz，H-3)]，两个次甲基[δH 4.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)和3.97(1H，dq，J=4.0，6.4 Hz，H-2)]质子信号.结合碳谱，可以发现两个次甲基分别连有羟基[δC 76.6(C-1)和71.2(C-2)]，比较两个次甲基质子耦合常数(J1-2=4.0 Hz)，推测两个羟基以erythro构型存在.此外，氢谱低场部分显示存在一个1，3，4三取代的苯环结构单元，剩余取代基团分别归为氯原子、甲氧基.经与文献比对[6，7]，化合物1被鉴定为erythro-1-(3'-Chloro-4'-methoxyphenyl)-1，2-propanediol(Trametol).

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.22(1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6')，6.92(1 H，d，J=8.4 Hz，H-5')，4.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)，3.97(1H，dq，J=4.0，6.4 Hz，H-2)，3.91(3H，s，-OCH3)，1.08(3 H，d，J=6.4 Hz，H-3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：154.6(C-4')，133.5(C-1')，128.6(C-2')，126.1(C-6')，122.4(C-3')，111.8(C-5')，76.6(C-1)，71.2(C-2)，56.2(-OCH3)，17.4(C-3).EI-MS m/z 216.14[M]+，218.15[M+2]+.

化合物2为白色不定型粉末.EI-MS m/z 186.13[M]+和188.12[M+2]+显示的分子离子峰暗示化合物2含有氯原子.结合NMR数据，推测化合物分子式为C8H7ClO3.氢谱、碳谱显示化合物为一个1，3，4三取代苯环结构，其中取代基分别归属为甲氧基(δH 3.96)、氯原子、羧基(δC 166.3).经与文献比对[8]，化合物2被鉴定为3-Chloro-4-methoxybenzoic Acid.

化合物3为白色不定性粉末.EI-MS m/z 220.09[M]+和222.09[M+2]+显示的分子离子峰暗示化合物2含有氯原子.结合NMR数据，推测化合物分子式为C8H6Cl2O3.氢谱和碳谱暗示化合物为1，3，4，5四取代苯环结构，取代基分别归属为一个甲氧基(δH 3.86)、二个氯原子、一个羧基(δC 165.4).经与文献比对[9，10]，化合物3被鉴定为3，5-Dichloro-4-methoxybenzoic Acid.

化合物4为白色不定型粉末.根据EI-MS和NMR数据，推测化合物分子式为C9H10O4.氢谱显示化合物为1，3，4三取代的苯环结构，取代基包括两个甲氧基(δH 3.85和3.83)、一个羧基(δC 168.3).经与文献比对[11]，化合物4被鉴定为3，4-Dimethoxybenzoic acid(Veratric acid).

化合物5为黄色油状液体.根据EI-MS和NMR数据，推测化合物分子式为C7H6O3.氢谱和碳谱显示化合物为1，4二取代苯环结构，取代基分别为羟基和羧基(δC 168.1).经与文献比对[12]，化合物5被鉴定为p-Hydroxybezoic Acid.

5 结果与讨论

半伏小薄孔菌A.semisupina隶属于担子菌，常生长于阔叶树上，引起木材白色腐朽，主要分布在中国、日本、新西兰和美国.目前关于半伏小薄孔菌A.semisupina的研究仅仅限于分类学[13]，未见半伏小薄孔菌的次级代谢产物报道.少量文献研究了小薄孔菌属微生物的代谢物，主要为没药烷型倍半萜[14]、三并五环倍半萜、gymnomitrane型倍半萜[15]、蛇麻烷型倍半萜[16]和吲哚类生物碱[17].本文是首次报道半伏小薄孔菌A.semisupina的次级代谢产物1-5，所有化合物进行了MDA-MB-231细胞抑制活性评价，数据显示没有该乳腺癌细胞抑制活性.该菌合成陆生微生物少见生产的含氯化合物，在生物合成途径和生物代谢酶方面具有重要的参考和研究价值.