特异性识别草鱼呼肠孤病毒感染细胞的ssDNA核酸适配体筛选与鉴定

余庆　刘明珠　李梦梦　肖贺贺　韦信贤　童桂香　吴思婷　李鹏飞

摘要：【目的】篩选出能高特异性和高亲和性识别草鱼呼肠孤病毒（GCRV）感染细胞的核酸适配体，为研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV检测技术打下基础，同时为提高水产疫病检测及防控效率提供技术支持。【方法】以草鱼呼肠孤病毒I型（GCRVI）感染的宿主细胞为靶标，采用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）进行特异性核酸适配体筛选，并通过激光共聚焦显微技术和流式细胞术对筛选获得的核酸适配体性质进行系统分析。【结果】筛选获得的核酸适配体GVIK1能特异性识别并结合在GCRVI感染的草鱼肾脏组织细胞系（CIK）表面，但不识别正常的CIK细胞及石斑鱼神经坏死病毒广西株（GNNV）感染的石斑鱼脾细胞（GS）;其二级结构具有独特复杂的茎环结构，吉布斯自由能（△G）为-32.93 kJ/mol，无细胞毒性。核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的亲和常数（Kd）为148.22 nmol/L，即核酸适配体GVIK1与靶标细胞间的亲和力极强，达纳摩尔级别。核酸适配体GVIK1在靶标细胞表面的结合位点是细胞膜蛋白或膜蛋白相关结构，其在靶标细胞表面的结合位点出现在病毒感染后的第5 h。临床试验结果表明，筛选获得的核酸适配体GVIK1可作为高特异性分子探针用于诊断GCRV感染所致的草鱼出血病。【结论】基于SELEX技术筛选获得能特异性识别GCRVI感染宿主细胞的核酸适配体GVIK1，可作为核酸分子探针用于研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV快速检测技术，实现实时监测和有效防控。

关键词： 草鱼呼肠孤病毒（GCRV）;指数富集的配体系统进化技术（SELEX）;核酸适配体;靶蛋白

中图分类号： S941.41                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-3057-09

Abstract：【Objective】Aptamers that could recognize grass carp reovirus（GCRV） infected cells with high specificity and affinity were generated in this study， which laid the foundation for the development of GCRV detection technology with convenient operation， low cost， short time-consuming and high accuracy， and it could provide technical supports for improving the efficiency of detection and control of aquatic diseases. 【Method】Aptamer targeting GCRVⅠ infected host cells was selected via systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology（SELEX）， and further characterized by laser confocal microscopy and flow cytometry in this study. 【Result】The generated aptamer GVIK1 could specifically recognize and bind on the membrane of GCRVⅠ-infected Ctenopharyngon idellus kidney cells（CIK） cells， but not normal CIK cells or grouper nervous necrosis virus（GNNV） infected grouper spleen cells（GS）. Aptamer GVIK1 formed unique and complex stem-loop secondary structures， with Gibbs free energy（ΔG） value of -32.93 kJ/mol. Apta-mer GVIK1 showed no cytotoxicity. Aptamer GVIK1 could specifically recognize GCRV-infected CIK cells， with calculated dissociation constants（Kd） of 148.22  nmol/L， which indicated that the affinity between aptamer GVIK1 and target cells was rather strong， reaching nanomolar level. The binding site of aptamer GVIK1 on the surface of target cells was a membrane protein or membrane protein related structure， the binding site of aptamer GVIK1 appeared on the cells surface at 5 h post infection. The clinical trials results showed that the aptamer GVIK1 could serve as a highly specific molecular probe for the diagnosis of grass carp hemorrhagic disease caused by GCRV infection. 【Conclusion】Aptamer GCRVI generated by SELEX technology in this study can specifically recognize GCRVI-infected host cells. It can be used as the molecular probe to develop the rapid detection technology of GCRV with convenient operation， low cost， short time consuming and high accuracy， so as to realize real-time monitoring and effective prevention and treatments against GCRV infection.

Key words： grass carp reovirus（GCRV）; exponential enrichment technology（SELEX） ; aptamer;  target protein

Foundation item：Joint Foundation Key Support Project of National Natural Science Foundation of China（U20A 20102）;Key Research and Development Project of Guangxi（AB18221111）;Guangxi Natural Science Foundation （2019 GXNSFAA245054）

0 引言

【研究意义】草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）作为一种高致病性鱼类传染病毒，通常呈暴发式感染，即在极短时间内可导致草鱼大量感染死亡（杨映等，2015;刘世旭等，2018）。由GCRV引起的草鱼出血病在我国广泛存在，严重制约着我国草鱼养殖业的持续健康发展（Rao and Su，2015;Wang et al.，2016）。因此，研发出操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV快速检测技术，加强水产养殖过程中的监测和防控管理，对有效控制草鱼出血病的暴发流行具有重要意义。【前人研究进展】GCRV隶属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）水生动物呼肠孤病毒属（Aquareovirus），是引发草鱼出血病的高致病性传染病毒，感染后1周内的死亡率可达90%～100%，给我国的草鱼养殖业带来巨大经济损失（李贤等，2016）。GCRV除能感染草鱼外，还能感染布氏餐条（Hemicculter leuciclus）、青鱼（Mylopharyngodon piceus）及麦穗鱼（Pseudorasbora parva）等，且致死率极高（王方华和李安兴，2006）。研发操作便捷、检测精准的水产疫病快速诊断试剂盒，并科学施药，能实现对水产疫病的有效防控（李鹏飞等，2018b，2019）。Seng等（2004）曾利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、曾伟伟等（2013）采用酶联免疫吸附（ELISA）分别实现对GCRV的成功检测，但这些方法存在操作繁琐、仪器昂贵、检测耗时长和试剂保存条件苛刻等缺陷，无法满足对规模养殖现场进行大批量样品快速检测的需求，因此亟需开发新型、高效、特异性强的病毒检测技术，用于草鱼出血病的快速诊断。指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology，SELEX）是一種前沿的生物文库筛选技术，是利用化学随机合成的单链寡核苷酸文库作为起始筛选库，将其与靶标物质在体外孵育结合，经反复多轮筛选，最终获得能高特异性识别结合靶标物质的单链核酸分子，即核酸适配体（Ellington and Szostak，1990;Yu et al.，2021b）。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰及稳定性强等优点，作为传统抗体的替代物，已广泛应用于疾病诊断治疗等生命科学领域的相关研究（Pang et al.，2018;Yu et al.，2019c，2020;Liu et al.，2020）。由于核酸适配体能高特异性和高亲和性识别并结合病原或病变细胞，可作为一种新型分子探针用于构建高灵敏生物传感器（余庆等，2020）。Duan等（2016）利用SELEX技术分别筛选获得能高特异性识别结合致病菌沙门氏菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的核酸适配体，并基于相关核酸适配体构建了多种检测方法，实现对致病菌的快速精确检测。巫朦朦等（2019）运用SELEX技术从全长为79个核苷酸包含35个随机碱基序列的单链DNA文库中筛选获得1条与粪肠球菌能特异性结合的适配体Apt21，可作为粪肠球菌检测的识别元件，为建立基于适配体的新型粪肠球菌检测方法奠定了基础。【本研究切入点】鉴于GCRV对草鱼养殖业的危害性，当前亟待建立一种操作便捷且准确度高的GCRV快速检测方法，以确保草鱼养殖业的持续健康发展。【拟解决的关键问题】以GCRV感染的宿主细胞为靶标，综合运用SELEX技术、磁性分离技术、激光共聚焦显微技术及流式细胞术等，筛选出能高特异性和高亲和性识别GCRV感染细胞的核酸适配体，为研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV检测技术打下基础，同时为提高水产疫病检测及防控效率提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

草鱼呼肠孤病毒I型（GCRVI）、石斑鱼虹彩病毒广西株（Grouper iridovirus Guangxi strain，SGIV）、石斑鱼神经坏死病毒广西株（Grouper nervous necrosis virus Guangxi strain，GNNV）、草鱼肾脏组织细胞系（Ctenopharyngon idellus kidney cells，CIK）及石斑鱼脾细胞（Grouper spleen cell，GS）均由广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室保存提供（Li et al.，2015a）;25 cm2细胞培养瓶、细胞96孔板、细胞12孔板、细胞6孔板购自美国Corning公司;35 mm玻底培养皿购自杭州欣友生物技术有限公司;链酶亲和素标记的纳米磁珠购自美国Thermo公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR纯化回收试剂盒、DL50 bp Marker、DL2000 DNA Marker、pMD19-T载体及大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司;磷酸缓冲盐溶液（PBS）和LB固体培养基（氨苄抗性）购自北京索莱宝科技有限公司。主要仪器设备：激光共聚焦显微镜（日本Nikon公司）、流式细胞仪（FACSAria II，美国BD公司）、多功能酶标仪（美国Thermo公司）、超微量分光光度计（美国Thermo公司）、PCR仪（德国Eppendorf公司）、荧光定量PCR仪（qTOWER3G Touch，德国Analytikjena公司）及凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）。

1. 2 起始筛选文库设计与合成

起始筛选文库为随机单链核酸文库，委托生工生物工程（上海）股份有限公司制备合成。文库中的每条单链核酸均为95 bp，中间随机核酸序列为50 bp，中间序列两端的核酸序列分别为5'-GACGCTTACT CAGGTGTGACTCG-3'和5'-CGAAGGACGCAGA GAAGTCTC-3'。5'端正向链引物和3'端反向链引物序列分别是5'-GACGCTTACTCAGGTGTGACTC G-3'和5'-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3'。

1.3 靶標细胞（GCRVI感染CIK细胞）准备

参照Xiao等（2019）、Yu等（2019d）的方法，将复苏的CIK细胞转入细胞培养瓶中，28 ℃恒温培养24 h后接入10 ?L GCRVI（107 TCID50/mL），28 ℃继续培养48 h，移除细胞培养瓶中的培养基，使用PBS洗涤3次，收集到的细胞即为GCRVI感染细胞（靶标细胞）。

1. 4 SELEX技术筛选流程

利用SELEX技术筛选出能高特异性识别结合靶标细胞的核酸适配体，具体操作步骤如下：取5 nmol随机单链寡核苷酸文库在92 ℃水浴锅中变性处理8 min，然后迅速插入冰水中复性15 min，溶解于200 ?L PBS中;文库与正常CIK细胞在冰上孵育结合40 min，收集上清液;将上清液与靶标细胞在冰上孵育结合40 min，用PBS轻轻洗涤3次以除去特异性结合不强的单链寡核苷酸。随后将靶标细胞在92 ℃水浴锅中处理5 min，1000×g离心3 min，收集上清即获得靶标细胞上结合的单链寡核苷酸;以单链寡核苷酸为模板进行PCR扩增。所用引物为羟基荧光素（6-carboxy-fluorescein，FAM）修饰的正向引物（FAM-FP）和生物素（Biotin）修饰的反向引物（biotin-RP）。扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行20个循环;72 ℃延伸5 min，获得双链DNA产物。

通过链霉亲和素—生物素反应，对双链DNA产物进行分离，以获得用于下一轮SELEX筛选的单链DNA核酸文库。具体操作步骤如下：将100 ?L链酶亲和素标记的磁珠与双链DNA在28 ℃下孵育10 min，使双链DNA特异性结合到纳米磁珠表面，然后用磁性分离器将磁珠从溶液中分离出来。移除溶液后，在磁珠中加入PBS反复洗涤3次，再加入200 ?L NaOH溶液（200 mmol/L），28 ℃孵育15 min，此时双链DNA分解成单链DNA，生物素标记的反向单链DNA结合在磁珠表面，而正向单链DNA游离在上清液中。收集上清液，使用HCl溶液调节上清液pH，然后采用PCR纯化回收试剂盒纯化回收正向单链DNA，用于下一轮SELEX筛选。为了确保每轮获得的单链核酸文库特异性和亲和力不断提高，在随后的SELEX筛选中会逐步增加PBS洗涤靶标细胞的次数，并逐渐减少单链核酸文库与靶标物质的结合时间，以及减少靶标细胞和单链核酸文库的使用数量。

1. 5 核酸适配体序列确定

以最终获得的单链寡核苷酸文库为模版，使用普通5'端正向引物（FP）和3'端反向引物（RP），经PCR扩增为双链核酸。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对核酸进行切胶回收，将其连接至pMD19-T载体并转化DH5α感受态细胞，然后将DH5α感受态细胞均匀涂布于氨苄抗性LB培养基上，置于28 ℃生化培养箱中倒置培养16 h，挑取单克隆进行测序，以获得核酸适配体序列。核酸适配体委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，5'端标记FAM荧光标签（FAM-aptamer）。核酸适配体二级结构和吉布斯自由能（ΔG）采用MFOLD进行预测分析。

1. 6 激光共聚焦技术分析核酸适配体识别结合靶标细胞特异性

将CIK细胞接入玻底培养皿中，28 ℃培养24 h后接入GCRVI，28 ℃继续培养48 h，使用光学显微镜观察靶标细胞的病变情况。FAM-aptamer（500 nmol/L）经92 ℃恒温水浴、冰浴复性处理后加入玻底培养皿中，4 ℃孵育结合20 min，用PBS轻轻洗涤，略干燥后以抗荧光淬灭剂封片，置于激光共聚焦显微镜下进行荧光信号观察。对照组共3组：不接入病毒CIK细胞、SGIV感染GS细胞及GNNV感染GS细胞。

1. 7 流式细胞术定量分析核酸适配体识别结合靶标细胞特异性

FAM-aptamer（500 nmol/L）经92 ℃恒温水浴及冰浴复性处理后，与靶标细胞4 ℃孵育20 min;孵育结束后用PBS轻轻洗涤，混匀至400 ?L PBS中，使用流式细胞仪上机检测。对照组共3组：不接入病毒CIK细胞、SGIV感染GS细胞及GNNV感染GS细胞，每组设3个平行。

1. 8 核酸适配体细胞毒性分析

将CIK细胞接入细胞96孔板，28 ℃培养24 h。试验组将核酸适配体在细胞培养基中稀释成不同浓度（500、1000和2000 nmol/L）后接入CIK细胞;对照组为不接入核酸适配体的正常CIK细胞。各组细胞经28 ℃培养48 h后，分别加入20 μL CCK-8溶液，28 ℃再孵育4 h。然后在酶标仪450 nm处检测其吸光值，以检测各组细胞的活性。每组细胞均设3个重复。将各组样品测得的吸光值代入以下公式，计算各组细胞存活率（Survival rate，SR）（Yu et al.，2020）：

SR（%）=OD450 nm（试验组）/OD450 nm（对照组）×100 （1）

1. 9 核酸适配体结合靶标细胞的亲和常数

FAM-aptamer经92 ℃恒温水浴及冰浴复性处理后，稀释至不同浓度（0～1000 nmol/L），与靶标细胞4 ℃避光孵育20 min;孵育结束后用PBS轻轻洗涤，混匀至PBS中，使用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。对照组为与FAM-aptamer孵育的正常CIK细胞。每组细胞均设3个重复。使用Sigmaplot计算核酸适配体的亲和常数（Kd），具体计算公式如下：

Y=Bmax*X/（Kd+X）           （2）

式中，Bmax表示核酸适配体与靶标细胞结合的最高荧光强度;Y表示稀释至不同浓度的核酸适配体与靶标细胞结合的荧光强度平均值;X表示核酸适配体浓度。

1. 10 核酸适配体的靶标性质分析

靶标细胞与FAM荧光标记的核酸适配体（500 nmol/L）在4 ℃下避光结合20 min后，使用胰酶對其进行消化处理2 min，然后用PBS轻轻洗涤，混匀于PBS中，使用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度;对照组为靶标细胞与FAM-aptamer（500 nmol/L）孵育结合的荧光强度。每组细胞均设3个重复。

1. 11 核酸适配体靶标分子出现在靶标细胞表面的时间分析

CIK细胞在细胞12孔板28 ℃培养24 h后接入GCRVI，再置于28 ℃细培养箱中继续培养。通过光学显微镜观察细胞病变情况，并分别在接入GCRVI后1、2、3、4、5、6和7 h时收集细胞，与FAM-aptamer （500 nmol/L）在4 ℃下避光孵育结合20 min，然后用PBS轻轻洗涤，混匀于PBS中，使用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度;对照组为正常CIK细胞与FAM-aptamer（500 nmol/L）孵育结合的荧光强度。每组细胞均设3个重复。

1. 12 核酸适配体检测GCRVI感染组织

取体形相近的草鱼（体长10～12 cm/尾，体重30～40 g/尾），空腹24 h后腹腔注射100 ?L GCRVI（107 TCID50/mL），注射24 h后采集草鱼肾脏组织;以未经处理的健康草鱼（对照组1）和注射100 ?L PBS的草鱼（对照组2）为对照组。各组样品均取100 mg用PBS漂洗后切碎，重悬于400 ?L PBS，并分别稀释为1/100（试验组1）和1/10（试验组2）。各组样品均与FAM荧光标记的核酸适配体（500 nmol/L）在4 ℃下避光结合20 min，以PBS轻轻洗涤后再重悬于100 ?L PBS，置于水浴锅中92 ℃处理3 min，5000×g离心3 min，收集上清液，采用荧光酶标仪进行检测。每组样品均设3个重复。

2 结果与分析

2. 1 特异性识别靶标细胞的核酸适配体

FAM荧光标记的各轮单链核酸文库（500 nmol/L）与靶标细胞结合后，使用流式细胞仪对靶标细胞的荧光强度进行检测，结果显示，随着筛选轮数的增加，靶标细胞表面的荧光强度逐渐增强，即单链核酸文库识别结合靶标细胞的特异性逐步增强;经过8轮筛选，第6轮筛选获得的单链核酸文库与靶标细胞孵育结合后，靶标细胞的平均荧光强度最高，即第6轮筛选获得的单链核酸文库对靶标细胞的特异性结合能力最强（图1）。选取第6轮的单链核酸文库进行克隆及测序分析，获得核酸适配体GVIK1，其两端的固定核苷酸序列无变化，中间50 bp的核苷酸序列为5'-TTCGGCGGATCTAACTTTGTCGTGGGAAACG GGGCGGACTTCACACTCGC-3'。FAM荧光标记的核酸适配体GVIK1（FAM-GVIK1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2. 2 核酸适配体GVIK1二级结构和吉布斯自由能预测分析结果

采用MFOLD对核酸适配体GVIK1二级结构和吉布斯自由能进行预测分析，结果表明，核酸适配体GVIK1二级结构具有独特复杂的茎环结构，其△G为-32.93 kJ/mol（图2）。

2. 3 激光共聚焦技术定性分析核酸适配体GVIK1对靶标细胞的特异性识别

将FAM-GVIK1分别与靶标细胞、CIK细胞、SGIV感染GS细胞及GNNV感染GS细胞在4 ℃下孵育结合和洗涤后，利用激光共聚焦显微镜进行观测，结果（图3）表明，在靶标细胞表面出现明显的FAM荧光信号，而其他对照细胞均无明显的荧光信号，说明核酸适配体GVIK1能特异性识别结合在GCRVI感染的CIK细胞表面。

2. 4 流式细胞仪分析核酸适配体GV1K1对靶标细胞的特异性识别

将FAM-GVIK1分别与靶标细胞、CIK细胞、SGIV感染GS细胞及GNNV感染GS细胞在4 ℃下孵育结合和洗涤后，利用流式细胞仪检测各组细胞表面的FAM荧光强度，结果（图4）显示，靶标细胞表面的荧光强度极显著高于其他对照细胞表面的荧光强度，进一步说明核酸适配体GVIK1能高特异性识别结合在GCRVI感染的CIK细胞表面。

2. 5 核酸适配体GVIK1的细胞毒性分析结果

通过细胞毒性试验进一步验证核酸适配体GVIK1的细胞毒性，结果（图5）表明，与正常的CIK细胞相比，CIK细胞与不同浓度（500、1000和2000 nmol/L）的核酸适配体GVIK1孵育结合后，其细胞存活率分别为97.26%、102.96%和100.05%，说明核酸适配体GVIK1无细胞毒性。

2. 6 核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的Kd

利用流式细胞术检测FAM-GVIK1特异性结合靶标细胞的平均荧光强度，然后代入公式（2）计算核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的Kd。如图6所示，核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的Kd为148.22 nmol/L，即核酸适配体GVIK1与靶标细胞间的亲和力极强，达纳摩尔级别。

2. 7 核酸适配体GVIK1的靶标分子鉴定结果

靶标细胞与FAM-GVIK1（500 nmol/L）在4 ℃下进行避光结合及胰酶消化处理后，使用流式细胞术检测靶标细胞的荧光强度。与对照组的靶标细胞相比，核酸适配体GVIK1结合靶标细胞表面的荧光强度极显著升高，但经胰酶消化处理后，靶标细胞表面的荧光极显著降低（图7），说明核酸适配体GVIK1在靶标细胞表面的结合位点是细胞膜蛋白或膜蛋白相关结构。随后使用流式细胞仪分析核酸适配体GVIK1靶标分子在靶标细胞表面的出现时间，结果（图8）显示，FAM-GVIK1与靶标细胞的结合量在GCRVI感染的第5 h显著升高，即核酸适配体GVIK1在靶标细胞表面的结合位点出现在病毒感染后的第5 h。

2. 8 核酸适配体GVIK1对GCRV感染草鱼肾脏组织的检测结果

FAM-GVIK1与各组草鱼肾脏织样品在4 ℃下避光结合后，使用荧光酶标仪进行检测，结果（图9）表明，GCRVI感染草鱼肾脏组织样品（试验组1和试验组2）与FAM-GVIK1孵育结合后测得的荧光强度显著高于对照组（对照组1和对照组2）草鱼肾脏组织样品的荧光强度，说明核酸适配体GVIK1可作为高特异性分子探针用于诊断GCRV感染所致的草鱼出血病。

3 讨论

草鱼是我国最大宗的淡水养殖品种，2018年的草鱼年产量达550万t（农业农村部渔业渔政管理局等，2019）。但在高密度养殖条件下，草鱼的各种病害频繁暴发，其中GCRV是造成草鱼暴发性疫病的最主要病原之一，GCRV导致的草鱼出血病致死率高达90% （李贤等，2016）。至今，已针对GCRV研制开发出多种检测技术，包括基于抗体的免疫检测、PCR及环介导等温扩增技术（LAMP）等（Seng et al.，2004;Jing et al.，2013;Zhang et al.，2013），但这些方法并不适用于养殖现场开展大批量样品的快速检测。PCR能高灵敏度、高精确度检测出病原感染，但由于操作繁琐、检测所需的PCR仪价格昂贵及试剂保存条件苛刻等原因，因此PCR主要是专业技术人员在实验室条件下对少量样品进行病原精确检测。ELISA等免疫学检测技术因具有方便、快捷等优点而被广泛应用，但免疫學检测技术也存在一定局限（Li et al.，2016），包括抗体必须在低温条件下保存，不同批次间的抗体特异性和质量具有一定差异，且与结构类似化合物易发生交叉反应而导致假阳性检测结果。因此，研发出操作便捷、特异性强、准确度高且适用于养殖现场使用的新型快检技术，是实现水产疫病病原快速检测及实时诊断的重要保障。

核酸适配体是一种新型的高特异性核酸分子探针，具有特异性强、亲和性高、合成成本低、易修饰及稳定性强等优点（Tan et al.，2013;Yu et al.，2021b），其二级结构通常具有典型的茎环结构，在氢键、疏水键、碱基堆积和范德华力等次级键的作用下，能自发折叠形成复杂的三级立体结构。核酸适配体可通过空间构象变化和构型互补，实现对靶物质的特异性识别与结合（Li et al.，2014）。目前，国内外学者已针对多种病原筛选获得特异性的核酸适配体。其中，细菌性病原包括单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（Duan et al.，2013a）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）（Duan et al.，2013b）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）（Savory et al.，2013）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）（Zhang et al.，2013;Yu et al.，2019a）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（Moon et al.，2015）及鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）（Moon et al.，2015）等;病毒性病原包括狂犬病病毒（Rabies virus）（Liang et al.，2012）、虹彩病毒（Iridovirus）（Li et al.，2015a，2015b;Yu et al.，2020，2021a）、流感病毒（Influenza virus）（Li et al.，2016）、细小病毒（Muscovy duck parvovirus）（Lu et al.，2018）及神经坏死症病毒（Nervous necrosis virus）（Yu et al.，2019b;Zhou et al.，2020）等。本研究以GCRVI感染的宿主细胞为靶标，成功筛选获得特异性分子探针——核酸适配体GVIK1。核酸适配体GVIK1长度为95 bp，其二级结构具有典型的茎环结构，△G为-32.93 kJ/mol;GVIK1能特异性识别结合GCRVI感染细胞（靶标细胞），但不识别CIK细胞、SGIV感染GS细胞及GNNV感染GS细胞。核酸适配体亲和力能指示核酸适配体结合靶标分子的强度（Li et al.，2015a）。本研究结果表明，核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的亲和力达纳摩尔级别，其亲和常数（Kd）为148.22 nmol/L，与本课题组先前报道的其他核酸适配体亲和力（Liang et al.，2012;Li et al.，2015a;Yu et al.，2019b，2020）一致。

近年来，国内外学者已利用核酸适配体研发出多种可快速、精确诊断水产疫病的新型检测技术或生物传感器（Tan et al.，2013;Duan et al.，2016;Li et al.，2016;Yu et al.，2021b），Zhou等（2017）基于核酸适配体Q3研发出Q3-ELASA，李鹏飞等（2018a）基于核酸适配体Q5研发出荧光分子探针检测技术（Q5-AFMP）;且Q3-ELASA和Q5-AFMP在诊断石斑鱼虹彩病毒病及石斑鱼病毒性神经坏死症时具有成本低、耗时短、操作便捷、准确度高等优点，其灵敏度与PCR相当。在本研究中，核酸适配体GVIK1能特异性识别GCRVI感染CIK细胞，但不识别正常的CIK细胞，说明GVIK1的靶标是在病毒感染宿主细胞后出现在细胞表面，且靶标出现的时间是病毒感染后第5 h。这些靶物质作为生物标志物出现，提示细胞处于病理或某种特定状态下，因此核酸适配体可用于发现传统方法无法探测的新型分子事件（Huang et al.，2011）。Yu等（2019c，2020）利用特异性识别SGIV感染细胞的核酸适配体Q5，鉴定出Q5的靶标蛋白即SGIV病毒的主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP），并证实SGIV病毒在侵染过程中其MCP会出现在病毒感染的细胞膜上，然后通过网格蛋白介导的内吞在病毒感染细胞中转运，而此过程依赖于动力蛋白、胆固醇、低pH及肌动蛋白丝。

4 结论

基于SELEX技术筛选获得能特异性识别GCRVI感染宿主细胞的核酸适配体GVIK1，可作为核酸分子探针用于研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV快速检测技术，实现实时监测和有效防控。

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（責任编辑 兰宗宝）