提高断血流提取物指标成分得率的工艺研究

刘文佳 黄光伟 黄 静 梁雪松

(柳州两面针股份有限公司，广西，柳州，545001)

前言

断血流来源于唇形科风轮菜属植物风轮菜Clinopodium chinense (Benth) O. Kuntze 和荫风轮 Clinopodium pdycephalum (Vaniot) C. Y. Wuet Hsuan 植物的干燥地上部分，为 2015年版《中华人民共国药典》收载的常用中药, 具有凉血、止血之功效, 临床上是一种止血良药, 主要用于治疗崩漏、尿血、鼻衄、牙龈出血、创伤出血、子宫肌瘤出血等出血症[1]。断血流所含成分比较复杂, 主要含有醉鱼草皂苷Ⅳb[2,3]、香蜂草苷、橙皮苷、β甾醇[4]、异樱花素-7-芸香糖苷、芹菜素[5]、洋芹素[6]、熊果酸[7]、蒲公英赛醇[8]等成分, 其中三萜皂苷类为其主要成分。经现代药理研究和临床试验证明, 其皂苷类成分具有治疗各种出血、单纯性紫癜、原发性血小板减少性紫癜等作用[9-12], 其中醉鱼草皂苷Ⅳb为有效成分之一。因此, 将断血流中醉鱼草皂苷Ⅳb最大限度地提取出来，对提取物功效是具有重要现实意义的。

断血流提取工艺有水提醇沉法、醇提法、加酶提取法[13]等，水提醇沉法、醇提法使用较为普遍。由于药典未对断血流药材指标成分进行明确规定，对各研究的制备工艺条件优劣无法判断。本研究通过对中药提取物生产的两个重要阶段提取和浓缩工艺进行研究，系统地考察了提取溶剂、提取时间各影响因素对断血流指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb提取的影响, 拟优选出最佳制备工艺条件, 最大程度提高断血流提取物指标成分含量，以期为断血流的进一步开发利用提供一定的理论基础和工艺参考。

1 实验仪器与药品试剂

1.1 实验仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，配紫外检测器；旋转蒸发器(RE52-98型，上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州万合仪器制造有限公司)；电子分析天平(METTLER TOLEDO，ML204型)；超声波清洗机(功率250W，频率50kHz，广州维力超声电子设备有限公司)。

1.2 药品试剂

断血流药材，柳州市桂中大药房采购；醉鱼草皂苷IVb对照品，中国食品药品检定研究所(批号：110782-200602，含量以99.5%计)；甲醇为色谱纯；超纯去离子水；食用酒精。

2 指标成分含量测定方法

2.1 对照品溶液制备

称取醉鱼草皂苷Ⅳb对照品0.0050g，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀并使之溶解。此溶液浓度为50μg/mL，置于2℃～4℃保存。

2.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱，5μm，250×4.6mm；流动相：甲醇-水， 0min～5min，70%甲醇，5min～15min，70%～90%甲醇；检测波长为250nm；流速1.0mL/min；柱温30℃。

2.3 标准曲线制备

准确移取2.1对照品溶液适量以甲醇稀释配置标准工作系列溶液，制成浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。在上述2.2的色谱条件，分别取20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积(见图1)。以醉鱼草皂苷Ⅳb的浓度为X轴，其相应的峰面积为Y轴，绘制标准工作曲线。结果表明：醉鱼草皂苷Ⅳb在2.5μg/mL～20μg/mL范围内线性良好，回归方程为：

Y=30.6701X+1.9054

r=0.9999

图1 醉鱼草皂苷Ⅳb对照品色谱图

图2 样品色谱图

2.4 样品指标成分含量测定

将断血流药材按各工艺条件提取，最后浓缩制备成1∶1的断血流提取液(一份干药材制成一份提取物)。精密称取0.1g提取液置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀后，用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测样品溶液。在上述2.2的色谱条件，精密量取20μL注入高效液相色谱仪(样品色谱图如图2所示)，记录峰面积, 用回归方程计算样品制备成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量即得。

3 试验方法与结果

3.1 提取阶段-单因素考察

3.1.1 提取溶剂及浓度

在考虑实际生产及产品应用的基础上，选取水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇为提取溶剂，溶剂用量10倍，分别采用加热回流提取1h。按 2.4 项下方法制备样品溶液，并进行测定，结果如表1所示。由结果可知,用30%乙醇与50%乙醇提取及75%乙醇、与95%乙醇提取，其指标成分含量接近，表明在30%乙醇至50%乙醇之间及在75%乙醇至95%乙醇之间其指标成分提取率差别不大。综合考虑成本，故选取水、30%乙醇、75%乙醇作为正交试验水平。

表1 不同提取剂浓度对断血流提取物指标成分影响

3.1.2 料液比

称取100g药材5份，分别按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入75%乙醇溶液，加热回流提取 2 次，每次时间 2 h，按 2.4 项下方法制备样品溶液，并进行测定，结果如表2所示。结果显示，醉鱼草皂苷Ⅳb随着提取溶剂用量的增大而增加，提取越完全。综合成本考虑，故选用料液比 1∶8、1∶10、1∶12作为正交试验水平。

表2 不同料液比对断血流提取物指标成分影响

3.1.3 提取时间

称取100g药材5份，加入10倍量75%乙醇溶液，加热回流提取2次，提取时间分别按0.5、1.0、1.5、2.0、3.0h，按 2.4项下方法制备样品溶液，并进行测定，结果如表3所示。结果显示，醉鱼草皂苷Ⅳb随着提取时间的增大而增加，1.5 h后逐渐趋于平稳。综合成本考虑，故选用提取时间 1.0、1.5、2.0h作为正交试验水平。

表3 不同提取时间对断血流提取物指标成分影响

3.1.4 提取次数

称取100g药材5份，加入10倍量75%乙醇溶液加热回流提取1、2、3、4、5 次，每次提取时间为1h，按2.4项下方法制备样品溶液，并进行测定，结果如表4所示。结果显示，醉鱼草皂苷Ⅳb随着提取次数的增加提取越完全，2次后逐渐趋于平稳。综合成本考虑，故选用提取次数1、2、3次作为正交试验水平。

表4 不同提取次数对断血流提取物指标成分影响

3.2 提取阶段——正交试验优选提取工艺

3.2.1 正交设计

在单因素实验的基础上，以指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb的提取率为评价指标，考察提取溶剂浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)对提取工艺的影响。按 L9(34)正交表分别进行加热回流提取，按 2.4 项下方法制备样品溶液，并进行测定。正交试验因素水平见表 5，结果见表 6。

表5 实验因素水平表

表6 正交试验条件及结果

3.2.2 正交试验结果分析

采用直观分析，从表6中的极差计算结果可以看到，影响因素顺序依次为 A>B>C>D，溶剂浓度(A)为主要因素，且A3>A1>A2，故选其最优水平A3；料液比(B)为次要因素，且B3>B2>B1,故选其最优水平B3；提取时间(C)C3>C2>C1，故选择提取时间C3；提取次数(D)极差较小，从极差分析D2优于D1与D3，故选择提取次数D2。因此最佳提取工艺为A3B3C3D2，即以断血流药材12倍量的75%乙醇加热回流提取2次，每次2.0h。

3.2.3 验证试验

称取3份断血流药材，每份100g，依据正交试验结果的最佳提取工艺，平行实验3次，测定提取液中指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量。结果分别为668μg·g-1，689μg·g-1， 697μg·g-1。由此可知，在最佳试验工艺条件下，提取物指标成分含量相近，表明该工艺稳定可行。

3.3 浓缩阶段

以上述确定的最佳提取工艺条件对断血流进行提取，得到的提取液作为下述试验的样品。

3.3.1 浓缩方式

在预试验基础上，采用常压加热浓缩和减压加热浓缩(-0.08～-0.09MP)两种浓缩方式，以提取物指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量为依据，在60℃下浓缩2h，并进行3组平行实验。按 2.2项下色谱条件进行测定，结果如下表7所示。结果显示，采用常压加热浓缩方式断血流提取物中醉鱼草皂苷Ⅳb含量较减压加热浓缩高23%左右；说明在同样的条件下，常压加热浓缩更有利于断血流指标成分留存。故选择常压加热浓缩方式。

表7 不同浓缩方式对断血流提取物指标成分影响

3.3.2 浓缩温度

采用常压加热浓缩，分别控制浓缩温度在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下，浓缩时间为2h；浓缩结束后按浓缩液的量换算成1∶1的提取物测定指标成分含量。按 2.2项下色谱条件进行测定，结果如下表8所示。结果显示，随着浓缩温度的升高，断血流提取物中醉鱼草皂苷Ⅳb含量也随之提高，温度提高到90℃后，含量提高趋势趋于平缓。因此，将浓缩温度控制在90℃较为合适。在提取液提取工艺条件相同的条件下，提取液中醉鱼草皂苷Ⅳb含量应恒定在一定量，但却出现随着浓缩温度上升醉鱼草皂苷Ⅳb含量增加的情况，说明断血流提取液中存在其他与醉鱼草皂苷Ⅳb结构相似的物质，在高温下转变为醉鱼草皂苷Ⅳb，使其含量提高。

表8 不同浓缩温度对断血流提取物指标成分影响

3.3.3 浓缩时间

采用常压加热浓缩，分别控制浓缩时间为1h、2h、3h、4h、5h下，浓缩温度为100℃；浓缩结束后按浓缩液的量换算成1∶1的提取物测定指标成分含量。按 2.2项下色谱条件进行测定，结果如下表9所示。结果显示，断血流提取物中醉鱼草皂苷Ⅳb含量随着浓缩时间的增大而提高，浓缩时间到4小时后，含量趋于平稳。因此，综合考虑生产效率几能耗，将浓缩时间控制在4h较为合适。在提取液提取工艺条件相同的条件下，提取液中醉鱼草皂苷Ⅳb含量应恒定在一定量，但却出现随着浓缩时间上升醉鱼草皂苷Ⅳb含量增加的情况，与随浓缩温度提高其含量也随之提高一样，说明断血流提取液中存在其他与醉鱼草皂苷Ⅳb结构相似的物质，浓缩时间延长提高了转化率，从而使醉鱼草皂苷Ⅳb含量随之提高。

表9 不同浓缩时间对断血流提取物指标成分影响

3.3.4 验证试验

取在最佳提取工艺条件下提取的断血流提取液3份，采用常压加热浓缩进行3次平行试验，控制浓缩时间为4h，浓缩温度为90℃，最后将浓缩液调成1∶1的提取物；测定提取物中指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量。结果分别为1702μg·g-1，1657μg·g-1， 1715μg·g-1。由此可知，在采用常压加热浓缩，浓缩时间为4h，浓缩温度为90℃时，提取物指标成分含量较高且相近，表明该浓缩工艺稳定可行。

3.4 工艺对比试验

将本文研究得出的最佳提高断血流提取物指标成分提取浓缩工艺(A:75%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶12、加热回流提取2次，每次2h；提取液采用常压加热浓缩，浓缩温度为90℃，浓缩时间为4h。)与其它研究工艺(B：75%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶10、加热回流提取2次，每次2.5h；提取液采用减压加热浓缩(-0.08～-0.09MP)，浓缩温度为60℃，浓缩时间为3h。

取断血流药材6份，每份100g，按上述两种工艺方法进行3次平行试验，结果如表10所示，采用工艺方法A制备断血流提取物，其指标成分较工艺方法B提高了三倍。结果表明，本研究的断血流提取浓缩工艺，能显著的提高其指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量。

表10 工艺对比试验结果

4 结论

本研究优化了中药断血流提取物的制备工艺，以提高其指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量为主要目的。对制备工艺的提取阶段和浓缩阶段进行了考察，采用正交试验优化了提取阶段的最佳工艺：75%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶12、加热回流提取2次，每次2h；并对浓缩阶段的浓缩方式选择及其影响因素分别进行了试验，得出了最佳浓缩工艺方法：采用常压加热浓缩，浓缩温度为90℃，浓缩时间为4h；最后通过工艺对比试验验证，结果表明，本研究的断血流提取浓缩工艺，能显著的提高其指标成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量，较对比工艺含量提高了3倍，该工艺稳定可行，适应大生产要求。但断血流提取物其标成分醉鱼草皂苷Ⅳb含量在浓缩阶段随浓缩条件变化而显著变化的原因，还有待进一步深入研究。