酶解-分光光度法测定乳粉中L-色氨酸含量

田洪芸，王文特，王冠群，张海红，提靖靓

（山东省食品药品检验研究院山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，济南250101）

0引言

L-色氨酸是人体必需的8种必需氨基酸之一，只能通过食物来摄取，人体日常饮食中缺乏L-色氨酸会出现与蛋白质缺乏症类似的症状。此外，L-色氨酸能促进大脑神经细胞分泌神经递质五羟色胺，可缓解人体紧张情绪，改善人体睡眠，乳粉属于L-色氨酸含量较为丰富的食物之一[1-4]。

L-色氨酸易溶于水或乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀碱中较稳定。目前，我国还没有针对乳粉中L-色氨酸测定的方法标准，GB 5009.124-2016《食品安国国家标准食品中氨基酸的测定》标准采用酸水解样品，不适用于L-色氨酸的测定；国内外测定标准方法主要有分光光度法、电位滴定法和液相色谱法，其中分光光度法和液相色谱法是测定L-色氨酸的常用方法，上述方法均采用碱水解法处理样品，但碱水解条件会导致乳粉中L-色氨酸的降解，不适用于乳粉检测[5-11]。AOAC标准草案使用酶解法测定婴幼儿配方乳粉中L-色氨酸[12]。本文参照AOAC标准L-色氨酸测定的酶解法前处理方法，建立了采用紫外可见分光光度计测定乳粉中L-色氨酸的方法，经验证，方法的稳定性好、准确度高。

1原理

试样经蛋白酶酶解，在强酸性介质中，氧化剂存在下，L-色氨酸的吲哚环与对二甲氨基苯甲醛反应生成蓝色化合物，在一定范围内蓝色化合物的吸光度值与L-色氨酸含量成正比，用标准曲线定量。

2试剂和材料

2.1试剂和材料

市售全脂乳粉、标准乳粉1849a（NIST）；灰色链霉菌蛋白酶，XIV型,活力≥3.5 U/mg，德国西格玛；甲醇，色谱纯，国药试剂；乙酸，国药试剂；盐酸，国药试剂；Tris碱C 4H 11NO 3，国药试剂；浓硫酸，国药试剂；亚硝酸钠，国药试剂；对二甲氨基苯甲醛，国药试剂；L-色氨酸标准品（CAS号：73-22-3）；电子分析天平，日本岛津；紫外分光光度计，日本岛津；p H计，梅特勒；恒温培养箱，伯辉；离心机，转速≥9 000 r/min，德国贺默。

2.2试剂配制

2.2.1 Tris缓冲液（0.1 mol/L，pH=8.5）

称取6.0 g Tris碱于500 mL烧杯中，加水300 mL溶解，用1.0 mol/L盐酸溶液调节溶液的p H到8.5±0.05，将烧杯中的溶液转移至500 mL容量瓶中，水定容至刻度，混匀。

2.2.2蛋白酶溶液（5 mg/mL）

称量一定质量的蛋白酶，用Tris缓冲液稀释并定容，使蛋白酶浓度为5 mg/mL。注意不要摇动，避免起泡。临用现配，室温下6 h内稳定。

2.2.3硫酸溶液（21.2 mol/L）

量取589 mL硫酸，缓慢加入约350 mL水中，冷却后用水稀释至1 L。

2.2.4对二甲氨基苯甲醛溶液（1%）

称取1.00 g对二甲氨基苯甲醛用硫酸溶液溶解并定容至100 mL，临用时现配。

2.2.5亚硝酸钠溶液（0.2%）

称取0.10 g亚硝酸钠，溶解于50 mL水中，临用时现配。

2.3标准溶液的配制

2.3.1 L-色氨酸标准储备液（100μg/mL）

称取25 mg色氨酸标准品（精确到0.1 mg），用水充分溶解，定容至250 mL，贮存于4℃冰箱中保存，有效期1个月。

2.3.2 L-色氨酸标准系列溶液

准确移取色氨酸标准储备液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用水溶解至刻度，该标准系列浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、50μg/mL。

3实验过程

3.1试样处理

称取试样0.2 g（精确到0.1 mg），置于50 mL离心管中，依次加入2 mLTris缓冲溶液、0.5 mL蛋白酶溶液、0.2 mL甲醇，置于旋涡混合器上混合至试样全部溶解，并尽量减少试样溶液挂壁。将混合后的试样溶液置于50℃的恒温培养箱中酶解16 h。同时做空白试验。将盛有水解液的离心管取出，冷却至室温，加入12 mL甲醇，全部转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。取出约15 mL置于15 mL离心管中，以8 000 r/min～10 000 r/min的转速离心5 min～10 min，取离心后澄清液过0.22μm有机相尼龙滤膜，滤液备用。

3.2测定

分别移取2.00 mL试样滤液及标准系列溶液置于10 mL比色管中，分别加入5.00 mL对二甲氨基苯甲醛溶液，混匀，静置20 min后加入0.2 mL亚硝酸钠溶液，混匀，静置25 min。同时做试剂空白。

以试剂空白调零，在590 nm波长处测定吸光度值，以L-色氨酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

图1色氨酸测定标准曲线

3.3结果计算

试样中色氨酸的含量按式（1）计算：

式中：

X为试样中L-色氨酸的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；c为由标准曲线得到的试样测定液中L-色氨酸的含量，单位为微克（μg）；C 0为由标准曲线得到的空白试验测定液中L-色氨酸的含量，单位为微克（μg）；m为试样质量，单位为克（g）；V 1为试样液定容体积（mL）；V 2为显色时试样液移取体积（mL）。

3.4酶解条件的确立

3.4.1正交试验

参照AOAC标准规定的酶解条件以及蛋白酶的反应条件，设计了3因素（酶解时间、温度，酶的用量）3水平的正交试验，酶解时间考察14、16、18 h3个水平；酶解温度考察40、50、60℃3个水平；酶的用量考察250、500、1000μL 3个水平，结果详见表1。结果表明，正交试验结果最满意的为5号样品，酶解条件为酶的用量为1000μL，酶解温度为50℃，酶解时间为16 h。

表1正交试验结果

根据正交试验的结果，以1849a乳粉质控样（L-色氨酸含量为184±10 mg/100g）为实验样品，确定最佳酶解时间、温度和酶用量。

（1）酶解温度

酶的用量设定为1000μL，时间设定为16 h，考察40、45、50、55、60℃等不同温度下的测定结果，结果表明，当酶解温度为50℃时，样品达到酶解峰值，结果见图2。

图2在不同酶解温度下的测定结果

（2）酶解时间

酶的用量设定为1000μL，温度设定为50℃，分别考察不同酶解时间（14、16、18、20、22、24 h）的测定结果。试验表明，当酶解的时间超过16 h以后，结果趋于稳定，证明酶解充分。推荐的酶解时间为16 h，也可根据具体样品调节酶解时间，结果见图3。

图3在不同酶解时间下的测定结果

（3）酶的用量

酶解时间设定为16 h，温度设定为50℃，考察酶的用量对结果的影响。结果均为扣除试剂空白以后的结果。试验表明，当酶的用量超过0.5 mL以后，结果趋于稳定，说明当酶的用量为0.5 mL时，样品基本酶解完全，综合考虑到成本等问题，建议采用0.5 mL的酶用量，结果见图4。

图4不同酶用量下的测定结果

3.5显色条件的确定

3.5.1最大吸收波长的确立

使用浓度为10、20、30、40、50μg/mL的L-色氨酸标准溶液，按照3.2进行显色处理，对样液进行全波长扫描。

图5不同浓度L-色氨酸标准溶液全波长扫描曲线

由5个浓度梯度标准溶液的全波长扫描结果可知，显色液的最大吸收波长确定为590 nm。

3.5.2硫酸溶液浓度的选择

选取浓度为30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸标准溶液，考察硫酸溶液浓度变化对吸光度的影响。硫酸浓度分别为9、12、18、21.2 mol/L，吸光度随硫酸溶液浓度增大而增大，并逐渐趋于稳定，最终确定硫酸溶液浓度为21.2 mol/L测定结果最好，详见图6。

图6硫酸溶液浓度对吸光度影响

3.5.3对二甲氨基苯甲醛浓度

选取浓度为30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸标准溶液，其他反应条件不变，改变对二甲氨基苯甲醛浓度，考察其对标准溶液吸光度的影响。吸光度先随对二甲氨基苯甲醛浓度增大而增大，达到最高点后再缓慢下降。综合考虑，选择对二甲氨基苯甲醛的浓度为1%最合适，这与GB/T 15400-2018《饲料中色氨酸的测定》要求一致，见图7。

图7对二甲氨基苯甲醛浓度对吸光度影响

3.5.4亚硝酸钠浓度

选取浓度为30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸标准溶液，其他反应条件不变，改变对亚硝酸钠浓度，考察其对标准溶液吸光度的影响。总体上来说，吸光度是随亚硝酸钠浓度增大而缓慢下降的。综合考虑，认为亚硝酸钠浓度为0.2%最合适，这与GB/T 15400-2018《饲料中色氨酸的测定》要求一致，见图8。

表2准确度实验表

图8亚硝酸钠浓度对吸光度影响

3.5.5反应时间

显色反应涉及到两步反应，固定亚硝酸钠反应时间25 min，考察了30μg/mL标准溶液吸光度随对二甲氨基苯甲醛反应时间的变化。吸光度随反应时间增长，先增大后趋于稳定不变。因此选择对二甲氨基苯甲醛反应时间为20 min，详见图9。

图9对二甲氨基苯甲醛反应时间对吸光度影响

固定对二甲氨基苯甲醛反应时间20 min，考察30μg/mL标准溶液吸光度随亚硝酸钠反应时间的变化。吸光度随反应时间增长基本没有变化。考虑到为使反应充分和与GB/T 15400-1994一致，选择亚硝酸钠反应时间为25 min，详见图10。

4准确度和精密度实验

4.1准确度实验

对1849a质控样和全脂乳粉2个样品，进行3个浓度水平的加标实验（n=6）,计算回收率和相对标准偏差。

图10亚硝酸钠反应时间对吸光度影响

L-色氨酸的回收率在97.3%～102.5%之间，质控样及全脂乳粉测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.32%～1.72%之间，方法的回收率好，准确度高，完全能够满足实际样品检测的需求[13]。

4.2精密度实验

对1849a质控样、全脂乳粉和L-色氨酸营养强化奶粉3种样品进行精密度（n=6）实验，计算相对标准偏差。

表3精密度实验表（n=6）

1849a质控样的测定结果为179.6～186.5 mg/100g，均在标示的含量范围内（174～184 mg/100g），方法的准确度高。3种样品测定结果（n=6）的相对标准偏差RSD为1.2%～2.4%，说明方法的精密度较好[14]。

5结论

本文参照AOAC标准的酶解前处理方法，建立了一种使用分光光度计测定乳粉中L-色氨酸的检测方法。经验证，在0.5μg/mL～50μg/mL浓度范围内，方法的线性关系良好。采用1849a质控样、全脂乳粉等进行准确度和精密度实验（n=6），方法的回收率分布在97.3%～102.5%之间，相对标准偏差RSD分布在0.32%～1.72%之间；样品精密度实验结果相对标准偏差在1.2%～2.4%之间，方法的稳定性好。