灵芝菌丝体总三萜超声辅助提取工艺优化

刘奇，彭浩，2，*，乔伟，邓百万，2，赵航柯，曹丹

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中723000）

灵芝属（Ganoderma）真菌属于担子菌门（Basidiomycota），伞菌纲（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），灵芝科（Ganodermataceae）。灵芝是常用中药材之一，首次记载于《神农本草经》，并归其为“上品”[1]。世界上灵芝科的种类主要分布在亚洲、澳洲、非洲及美洲的热带及亚热带，少数分布于温带[2]。而我国灵芝主要分布于陕西、河北、山西、广西、云南、贵州等地区[3]。灵芝具抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂以及保肝护肝等多种药理作用[4]。

灵芝三萜类化合物作为灵芝的关键药效成分之一，现代药理研究证明，三萜类化合物具有抗氧化、保肝护肝、增强免疫、抗肿瘤、降血脂血糖、防治心血管疾病、缓解哮喘、抗人类免疫缺陷Ⅰ型病毒及HIV-1 蛋白酶活性、抑制组胺释放、抑制血小板聚集和防治癫痫等作用[1，5-6]。

现阶段获取灵芝三萜材料的方法大多是从人工栽培的子实体中，人工栽培子实体耗时费力，成本高，受环境因素的制约，产品的质量也难以得到保证。为了进一步完善灵芝三萜的提取效果，降低其提取过程中不稳定性，从灵芝菌丝体中提取灵芝三萜的工艺优化和分离技术研究具有重要意义。目前提取三萜的方法有：传统热提取[7]、索氏提取[8-9]、微波辅助提取[10-11]、超临界萃取[12]、超声波辅助提取[13-14]和微波-超声波协同提取[15]等，超声波辅助技术作为新兴的提取方法，其操作简便，节省时间，广泛受到研究者的青睐。

近年来，优化多糖、三萜物质提取工艺方面利用正交和响应曲面法效果良好，正交试验设计是一种高效率、快速、经济的试验设计方法[16]，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值；响应曲面法中，Box-Behnken 试验是一种有效、实用的方法，分析其各因素的最佳提取条件[17]。为了避免在试验中选择优化方法的随意性和盲目性，高效的寻找出最优的提取条件[18]。本试验采用正交试验和Box-Behnken 试验响应曲面法对灵芝菌丝体三萜超声辅助提取，显著提高了灵芝三萜的提取率，可为灵芝菌丝体中三萜的开发及其利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝：陕西省食药用菌工程技术研究中心；齐墩果酸：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、乙酸乙酯：天津市富宇精细化工有限公司；冰醋酸：天津市北联精细化学品开发有限公司；香草醛：天津市福晨化学试剂厂；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司。以上试剂均为分析纯。

723N 型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司制造；LRH-250-GS 数显式恒温培养箱：广东省医疗器械厂；SW-CJ-1F 超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；ZHWY-210 2C：上海志成有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；KQ5200DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DZKW-D-2 电热恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 灵芝菌丝体的培养

母种培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂 18 g，水 1 L，pH 值自然。

液体培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 5 g，磷酸二氢钾 3 g，硫酸镁 1.5 g，琼脂 18 g，水1 L，pH 值自然。

500 mL 三角瓶装液体培养基200 mL，接种1 块1 cm2菌块，使菌丝一面向上悬浮。置于恒温摇床内培养9 d，26 ℃、120 r/min 振荡，取发酵后的发酵液经真空泵抽滤的菌丝球，经蒸馏水洗涤3 次，弃去滤液，60 ℃烘干，研磨，备用。

1.2.2 试验材料预处理

取菌丝体粉末0.1 g，精密称定，置三角瓶中，加75 %乙醇5 mL 浸泡1.5 h，超声处理（功率100 W，频率 42 kHz，温度 70 ℃）30 min，滤过，滤液置 100 mL 量瓶中，用适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 灵芝三萜含量的测定

标准曲线的制作：取齐墩果酸1 mg，精密称定，加5 mL 乙醇，为对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置 15 mL 试管中，70 ℃挥干，放冷，精密加入新配置的香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，在70 ℃水浴中加热15 min，立即置冰水中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在546 nm 波长处测定吸光度，以吸光度A 为纵坐标、齐墩果酸浓度C（mL/μg）为横坐标绘制标准曲线。标准曲线线性回归方程为：A = 0.008 7C + 0.013 7，R2=0.999 2。

测定方法：精密量取供试品溶液0.2 mL，置15 mL试管中，按照标准曲线制作中“挥干”后步骤测定吸光度，从标准曲线上读出齐墩果酸的含量，计算，即得。样品总三萜得率按下列公式计算：

式中：m 为样品质量，mg；V 为吸取的滤液，mL；Y为灵芝三萜的含量，μg。

1.2.4 单因素试验

1）超声功率对灵芝菌丝体三萜提取率的影响：精准称取灵芝菌丝体粉末0.1 g，超声功率分别为60、70、80、90、100 W，超声时间 30 min，pH 值自然，超声温度70 ℃，料液比 1 ∶50（g/mL），考察超声功率对灵芝菌丝体三萜提取率的影响。

2）超声时间对灵芝菌丝体三萜提取率的影响：精准称取灵芝菌丝体粉末0.1 g，超声时间分别为10、20、30、40、50 min，超声功率 90 W，超声温度 70 ℃，料液比1 ∶50（g/mL），pH 值自然，考察超声时间对灵芝菌丝体三萜提取率的影响。

3）pH 值对灵芝菌丝体三萜提取率的影响：精准称取灵芝菌丝体粉末0.1 g，分别用0.1 mol/L HCl 溶液和0.1 mol/L NaOH 溶液进行酸碱调定，pH 值分别为5、6、7、8、9，超声时间 40 min，超声功率 90 W，超声温度70 ℃，料液比 1 ∶50（g/mL），考察 pH 对灵芝菌丝体三萜提取率的影响。

4）料液比对灵芝菌丝体三萜提取率的影响：精准称取灵芝菌丝体粉末 0.1 g，料液比分别为 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），超声时间 40 min，pH8，超声功率90 W，考察料液比对灵芝菌丝体三萜提取率的影响。

1.2.5 正交优化试验

在单因素试验的基础上，确定超声功率（A）、超声时间（B）、pH 值（C）、料液比（D）4 个因素作为影响灵芝菌丝体三萜提取率的工艺条件，设计四因素三水平的正交试验，采用L9（34）表安排试验，见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.2.6 响应面法试验设计

根据Box-Behnken 试验原理，依据单因素试验结果，超声时间（A）、pH 值（B）、超声功率（C）、料液比（D）作为考察变量，灵芝三萜提取率为响应值，以-1，0，1分别代表变量水平，建立数学模型。具体各因素水平见表2，采用Design Expert 8.0.6 软件进行试验设计。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Response surface test factor level table

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对灵芝菌丝体三萜提取率的影响

超声功率对灵芝菌丝体三萜提取率的影响见图1。

图1 超声功率对灵芝菌丝体三萜提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasound power on extraction rate of triterpenoids from Ganoderma lucidum mycelium

图1 表明，随着超声功率的逐渐增大，灵芝菌丝体三萜提取率呈上升趋向；当超声功率在90 W 时，灵芝菌丝体三萜提取率此时为较大，达0.718%，当超声功率为100 W 时，增长率降低，综合考虑到试验成本，因此，提取灵芝菌丝体三萜的最佳超声功率为90 W。超声功率过小，灵芝菌丝体细胞壁不完全破碎，三萜提取率较低；超声功率过大，溶液分子运动加快，破坏三萜结构。

2.1.2 超声时间对灵芝菌丝体三萜提取率的影响

超声时间对灵芝菌丝体三萜提取率的影响见图2。

由图2 可知，随着超声时间的逐渐增加，灵芝菌丝体三萜提取率呈上升趋势；当超声时间在40 min 时，灵芝菌丝体三萜提取率此时为最大，达到0.671%；之后随着超声时间的增大灵芝菌丝体三萜提取率无明显变化，可能细胞内外浓度达到平衡。因此，提取灵芝菌丝体三萜的最佳超声时间为40 min。

图2 超声时间对灵芝菌丝体三萜提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasound time on extraction rate of triterpenoids from Ganoderma lucidum mycelium

2.1.3 pH 值对灵芝菌丝体三萜提取率的影响

pH 值对灵芝菌丝体三萜提取率的影响见图3。

图3 pH 值对灵芝菌丝体三萜提取率的影响Fig.3 Effect of pH value on extraction rate of triterpenoids from Ganoderma lucidum mycelium

图3 表明，随着pH 值的逐渐增加，灵芝菌丝体三萜提取率呈上升趋向；当pH 值在8 时，灵芝菌丝体三萜提取率此时为最大，达0.759%；之后随着pH 值的增大灵芝菌丝体三萜提取率反而减小。灵芝三萜是一类具有酸性性质的四环三萜或者五环三萜，在碱性环境下可能使灵芝三萜结构发生变化。因此，提取灵芝菌丝体三萜的最佳pH 值为8。

2.1.4 料液比对灵芝菌丝体三萜提取率的影响

料液比对灵芝菌丝体三萜提取率的影响见图4。

图4 表明，随着溶剂体积增加，灵芝菌丝体三萜提取率逐渐增大，当料液比在1 ∶30（g/mL）时，灵芝菌丝体三萜提取率为最大，达0.736%；之后随着溶剂体积的增大灵芝菌丝体三萜提取率反而减少。因此，提取灵芝菌丝体三萜的最佳料液比为1 ∶30（g/mL）。溶剂量少，不利于超声空化作用和在溶剂中传播速度，因此三萜提取率降低；溶剂体积增加影响了机械学和热力学作用。

图4 料液比对灵芝菌丝体三萜提取率的影响Fig.4 Effect of liquid-liquid ratio on the extraction rate of Ganoderma lucidum mycelium

2.2 超声辅助提取灵芝菌丝体正交试验结果

根据单因素试验结果，以超声功率（A）、超声时间（B）、pH 值（C）、料液比（D）为变量，以灵芝菌丝体三萜为指标，进行正交试验，结果见表3。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal test results

表3 结果表明，从极差分析R 的大小可以看出，以灵芝菌丝体三萜提取率为指标时，C＞A＞D＞B，即对灵芝菌丝体三萜提取率影响最大的pH 值，其次是超声功率和料液比，影响最小的超声时间，筛选出最佳的工艺处方A2B3C2D3，即灵芝菌丝体三萜提取率最佳的工艺为：超声功率90 W、超声时间50 min、pH 8、料液比 1 ∶40（g/mL）。

2.3 正交试验最佳工艺及验证试验

取上述最佳工艺（超声功率90 W、超声时间50 min、pH 8、料液比 1 ∶40（g/mL）提取灵芝菌丝体三萜，试验重复5 次，结果见表4。

表4 最佳试验验证Table 4 Optimum test verification

由表4 结果表明，利用正交试验得出灵芝菌丝体三萜提取率稳定性较好、操作方便、提取率较高、提取工艺合理。

2.4 超声辅助提取灵芝菌丝体三萜Box-Behnken试验结果

按照表2 中因素水平，利用Design-Expert 8.0.6软件进行4 因素3 水平Box-Behnken 试验设计通过单因素试验，得出试验结果见表5。

表5 Box-Behnken 试验设计和结果Table 5 Box-Behnken design and result

续表5 Box-Behnken 试验设计和结果Continue table 5 Box-Behnken design and result

2.5 回归模型有效性以及显著性分析

通过表5 中的试验结果，在借助Design-Expert 8.0.6 软件分析处理，得到二次模型回归统计分析表，见表6。

表6 回归分析Table 6 Results of regression analysis

经Design-Expert 8.0.6 软件对29 个试验点的灵芝菌丝体三萜提取率进行回归统计分析，灵芝菌丝体三萜提取率的拟合回归方程：

Y=1.09+0.070A+0.076B+0.076C+0.082D+5.000×10-3AB+0.050AC+0.015AD+2.500×10-3BC+0.025BD-0.010CD-0.17A2-0.17B2-0.19C2-0.18D2

从表5 结果分析得出，A、B、C、D、AC、A2、B2、C2、D2、这9 项为差异极显著；BD 这项为差异显著；AB、AD、BC、CD 这3 项为差异不显著。由于模型F=108.27（P＜0.000 1）而且极显著，其可信度大于99.99%，则试验有价值、有意义。由显著性检验中决定系数R2=0.990 8 以及校正系=0.981 7 得知，该模型中的实际值与预测值具有较高相关性，并且能够很明显地反映出各个主要因素对灵芝菌丝体三萜提取率的影响。在表5 中失拟项P 值为0.543 5＞0.05，失拟项差异不显著，得出试验操作可信度，C.V=2.88%，说明该模型变异小，拟合较好。

通过以上结果均显示，使用该模型、方程代替真实的试验点，进行结果分析与预测是可行的，试验理论可进行。

2.6 响应曲面分析

根据回归方程绘制灵芝菌丝体三萜提取率随各因素变化的响应曲面图，见图5。图中反映所考察的4个因素（超声功率、超声时间、pH 值、料液比）。其中两个因素取0 水平时，另外两个交互作用分析。

图5 超声功率、超声时间、pH 值和料液比两两交互的响应曲面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for ultrasonic power，ultrasonic time，pH value and feed-to-liquid ratio

响应面图可以综合反映各因素对响应值的影响、因素与因素之间的交互作用。响应曲面坡度的平缓与陡峭程度，表明处理条件变化对响应值影响大小[14]。等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著[19]。综合分析，三维响应面图均为向下凹的曲线，这表明灵芝菌丝体三萜提取率有最大值。

2.7 响应面最佳工艺及验证试验

灵芝菌丝体三萜提取率通过回归模型获得影响各因素最值分别为：超声功率92.55 W、超声时间42.61 min、pH 8.27、料液比 1 ∶32.62（g/mL），得到了灵芝菌丝体三萜提取率的最大预测值为1.13%，考虑实际条件，确定最佳工艺条件：超声功率90 W、超声时间42 min、pH 8、料液比 1 ∶30（g/mL），利用上述各因素最优值进行验证试验，试验重复5 次，结果见表7。

表7 最佳试验验证Table 7 Optimum test verification

续表7 最佳试验验证Continue table 7 Optimum test verification

由表7 结果表明，获得验证灵芝菌丝体三萜平均提取率为1.09%，实际验证值与理论预测值结果非常接近，提取率高，工艺合理。因此，用上述最佳提取工艺是可行有效的。

3 结论

采用超声辅助提取灵芝菌丝体三萜，试验在单因素基础之上，通过正交试验得到优化最佳工艺：超声功率 90 W、超声时间 50 min、pH 8、料液比 1 ∶40（g/mL），利用最佳工艺条件下，得到平均灵芝菌丝体三萜提取率0.76%；Box-Behnken 响应曲面试验得到优化最佳工艺为：超声功率90 W、超声时间42 min、pH 8、料液比1 ∶30（g/mL）。利用最佳工艺条件下，得到灵芝菌丝体三萜平均提取率为1.09%。

这两种方法用于优化超声辅助提取灵芝菌丝体三萜的结果得出，正交试验法可以综合全面试验，快速简单易操作，试验次数少，根据结果选出重要影响因素，进而优化试验条件[20]。但无法对各因素效应及交互作用做出分析，并且模型是二维线性模型，因此会与实际情况有偏差。而响应面法可以在整个试验中找出影响因素与响应值之间的关系，进一步优化，虽然试验次数多，但能准确找出合适条件，试验准确度高。

综合比较两者，响应面试验优化灵芝菌丝体三萜提取率工艺明显高于正交试验优化灵芝菌丝体三萜提取工艺，而且响应面分析法是一种包括试验设计、建立模型、分析模型合理性和寻求最优解等众多试验的统计技术，因此采用Box-Behnken 响应曲面试验优化灵芝菌丝体三萜提取率工艺，提取工艺参数准确可靠，具有推广价值。