绍兴地区非结核分枝杆菌肺部感染情况分析

赵金云，金法祥，许文芳，许 鹏，童 丹

（绍兴文理学院附属医院 绍兴市立医院检验科，浙江 绍兴 312000）

非结核分枝杆菌（nontuberculousMycobacterium，NTM）在自然界中广泛存在，近年来，NTM感染率呈上升趋势。NTM主要可引起人类肺部感染，尤其是在伴有慢性阻塞性肺疾病、既往结核、囊性纤维化、支气管扩张、获得性免疫缺陷综合症和移植等相关危险因素的情况下，其感染风险更大。NTM还可引起淋巴结、皮肤软组织和中枢神经系统等其他部位感染[1-2]。由于NTM肺部感染的临床症状及影像学特征与肺结核相似，很多情况下会因漏诊而延误治疗，临床上通常借助病原学检测来进行区分[3]。不同种类NTM耐药谱不同，治疗方案也存在差异，因此NTM的准确鉴定对临床治疗具有重要意义。为了解绍兴地区NTM肺部感染的流行情况，本研究对2017年7月—2018年7月临床分离的NTM进行分析。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2017年7月—2018年7月绍兴文理学院附属医院及各县区医院临床样本2 768例（排除重复及没有完整结果记录的样本）。质控菌株结核分枝杆菌H37RV敏感株（ATCC 27294）由浙江省疾病预防控制中心提供。

1.2 主要仪器与试剂

BioMixerⅡ芯片杂交仪、LuxScan10k-B微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物有限公司）。罗氏培养基、药物敏感性试验培养基、对硝基苯甲酸培养基、噻吩-2-羧酸肼培养基购自珠海贝索生物技术公司；分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA 微阵列芯片法）购自北京博奥生物有限公司，可鉴定结核分枝杆菌复合群及17种临床常见的NTM。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养 在临床样本中加入1～2倍体积的4% NaOH溶液，振荡后静置15 min，采用无菌吸管吸取100 μL分别接种于罗氏培养基、对硝基苯甲酸培养基和噻吩-2-羧酸肼培养基，37 ℃培养箱培养。

1.3.2 菌种鉴定 按照分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）操作说明书，通过核酸提取、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增和芯片杂交、洗涤干燥等步骤制备样本芯片，最终通过芯片扫描仪及相应软件进行结果的判读。

1.3.3 比例法体外药物敏感性试验 制备1 mg/mL菌悬液，分别稀释成1×10-2与1×10-4mg/mL的菌液，再分别接种至含药异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、卷曲霉素、卡那霉素、丙硫异烟胺、氧氟沙星培养基和对照培养基，37 ℃培养4周后观察结果。以耐药率≥1%判为耐药。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。

2 结果

2.1 样本类型及患者临床特征

2 768例临床样本中，痰液样本1 761例、肺泡灌洗液样本696例、纤维支气管镜刷检物样本299例、肺组织样本12例。共分离出NTM 243株（8.77%）。243例NTM感染患者中，男性占77.37%，＜60岁的患者占65.43%；超过85.00%的患者同时患有其他疾病，患有慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张和肺炎的患者超过60.00%，见表1。有9例患者为结核分枝杆菌和NTM混合感染，其中1例为泛耐药结核分枝杆菌合并NTM肺部感染。6例肺癌患者中，仅1例NTM肺部感染得到控制，3例病情恶化，2例死亡；3例获得性免疫缺陷综合症患者均未能坚持治疗。

表1 243例NTM感染患者临床特征

2.2 NTM菌种鉴定

采用基因芯片法将分离所得的243株NTM进行菌种鉴定。居前3位的分别为胞内分枝杆菌（62.14%）、鸟分枝杆菌（19.75%）、龟或脓肿分枝杆菌（8.64%）。见表2。

表2 243株NTM菌种分布

2.3 药物敏感性试验结果

243株NTM对一线抗菌药物的耐药率均较高，除胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌对乙胺丁醇的耐药率分别为66.89%和62.50%外，NTM对其他一线抗菌药物的耐药率均高于80.00%，尤其是对异烟肼和链霉素，几乎均为100.00%；而NTM对二线抗菌药物的耐药率要低于一线药物，卡那霉素和卷曲霉素具有一定的抗菌作用，尤其是卡那霉素，常见NTM对其的耐药率均低于75.00%。

表3 243株NTM的耐药率

3 讨论

NTM是一种条件致病菌，广泛存在于水、土壤和气溶胶中，可致免疫力低下者广泛感染，轻者可致皮肤感染，重者会危及生命[1]。近年来，随着糖尿病、肺结核、获得性免疫缺陷综合症及免疫抑制治疗患者的增多，NTM感染病例显著增多。随着临床诊断技术的提高，NTM的检出率也明显增高[3]。NTM的种类和感染率存在着一定的地区差异性，且与气候、环境有关，呈现出南方高于北方、沿海高于内地、气候温和地区高于寒冷地区的流行特点[4]。NTM菌种鉴定的方法较多，传统的表型鉴定分析和生理生化方法步骤较繁锁、耗时长，且鉴定结果不准确。目前，对NTM进行菌种鉴定的方法主要是基于PCR技术的分子生物学方法，其他方法还包括噬菌体生物扩增法、高效液相色谱法、探针法及基因芯片法等，其中基因芯片法具有快速、简便、准确、敏感等优点[5]。

本研究共分离出243株NTM，检出率为8.77%，低于2010年全国平均水平（22.9%）和2015年广州地区水平（19.1%），但高于2015年江苏地区（2.35%）和2012年沈阳地区（1.87%）水平[6]。纳入的病例中，以男性患者居多，占77.37%，且以年龄＜60岁的中青年为主；只有13.17%的患者仅为NTM肺部感染，而其他绝大多数患者同时患有其他疾病，约70.00%的患者患有其他肺部疾病，包括慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺炎、肺结核和肺癌等。通过基因芯片技术对分离的NTM进行菌种鉴定，胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌是临床感染最常见的NTM，超过80.00%；其次为龟或脓肿分枝杆菌，与ZHENG等[7]的研究结果一致。本研究结果表明，绍兴地区堪萨斯分枝杆菌的检出率要稍高于其他地区[8]，这也说明NTM感染存在一定的地区差异性。有研究报道堪萨斯分枝杆菌最易侵犯的部位是肺，常侵犯晚期获得性免疫缺陷综合症患者[9]，与本研究分离自3例获得性免疫缺陷综合症患者NTM均为堪萨斯分枝杆菌的结果一致。本研究还分离出偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌等不常见的分枝杆菌，一般认为其很少引起肺部感染，常作为一类非致病性环境分枝杆菌污染水源及医疗器械等[10]。NTM由于种类不同，对抗菌药物的耐药性差异较大，从体外药物敏感性试验结果来看，NTM对一线抗菌药物均有着较高的耐药率，尤其是对链霉素和异烟肼，几乎达到了100.00%；而对二线抗菌药物的耐药率稍低，尤其是卡那霉素，分离率较高的4种分枝杆菌对其耐药率均低于75.00%，而堪萨斯分枝杆菌对卡那霉素的耐药率仅为31.25%。

综上所述，NTM肺部感染已成为不可忽视的疾病，尤其是患有肺部基础疾病的患者，更应警惕其发生。NTM肺感染疾病与肺结核临床症状相似，给临床诊断带来很大困难，并且NTM种类繁多，耐药率高，不同种类的NTM耐药谱有差异，这些情况加大了临床确定治疗方案的难度。因此，快速、准确地进行菌种鉴定有助于临床对患者进行早期诊断及治疗。