复方青黛丸联合MTX 治疗银屑病疗效及机制研究

季天皓，陈军毅，孟亚东

（1.上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院皮肤科，上海 202150；2.上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科，上海 202150）

银屑病是常见的慢性炎症性皮肤病，病理改变主要为角质形成细胞过度增殖伴角化不全。目前认为，银屑病发生、发展的主要机制是免疫细胞辅助性T细胞（helper T cell，Th）1和Th2的比例失调，并且Th1过表达促炎细胞因子如干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、白细胞介素（interleukin，IL）-12和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等[1-2]。

甲氨喋呤（methotrexate，MTX）是银屑病的一线治疗药物，其机制主要是抑制免疫细胞活性，调节Th1和Th2细胞比例，但长期使用存在一定副作用。中成药复方青黛丸主要成分有青黛、土获、丹参、白术、建曲等，具有抗炎、镇痛、止痒等作用。近年来，随着临床使用的增多，该药已渐渐成为基层皮肤科治疗银屑病的首选药物之一[3-4]，但对于中度以上银屑病患者，往往需要联合其他药物一并使用，如MTX。银屑病发生、发展的主要机制是Th1和Th2的失衡，目前尚不清楚复方青黛丸联合MTX是否会通过降低IFN-γ、IL-12和增加IL-4等的表达来调节银屑病中Th1占优势的免疫状态。因此，在本研究中，我们拟通过定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测复方青黛丸联合MTX和单用MTX治疗银屑病患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中GATA-3、T-bet、IL-4、IL-12和IFN-γ的表达，明确复方青黛丸联合MTX对银屑病患者PBMC中Th1和Th2相关因子mRNA表达的影响，开展银屑病患者Th1/Th2失衡状态的临床研究，评估临床表型与Th1、Th2细胞因子表达之间的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

根据银屑病患者皮损面积和严重程度指数评分（psoriasis area and severity index，PASI），选取评分＞10的寻常型银屑病患者。排除有以下情况的患者：1型糖尿病；肥胖[体质量指数（body mass index，BMI）＞25]；心血管疾病；妊娠状态；有肝病史或研究期间饮酒；外用过MTX；2个月内接受过光疗；2个月内服用过复方青黛丸或非处方银屑病治疗药物；因任何原因放弃参与本研究[5]。最终纳入50例斑块型银屑病患者，其中男32例、女18例，年龄为21～59岁。

1.2 方法

以单用MTX治疗者为对照组，复方青黛丸联合MTX治疗者为治疗组。2个组受试者都经MTX治疗，持续8周。在8周内，治疗组的受试者同时服用复方青黛丸（3次/d，6 g/次）。在研究开始（基线）和结束时均通过PASI评分系统评估银屑病严重程度。本研究将PASI-75设为阈值和临床有效性指标[6]。此外，收集和统计受试者年龄、发病年龄、体质量、BMI和皮肤生活质量指数（dermatology life quality index，DLQI），DLQI主要通过皮肤病生活质量表评价2个组患者日常活动、症状、人际关系、工作和学习、感受情况等5项生活质量评分，分数越低说明患者生活质量越优。

1.3 分离PBMC

收集每例受试者4mL血液至乙二胺四乙酸采血管中。将血液样品在室温下放置60 min，然后以978×g离心20 min。使用Ficoll（比重：1.077）从血液样品中分离PBMC。将分离的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤2次。

1.4 实时荧光定量 PCR

通过实时荧光定量PCR测定T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-12和IL-4的mRNA表达。使用Trizol（瑞士罗氏公司）从PBMC中分离总RNA。采用Prime-Script TM、RT试剂盒（日本TaKaRa公司）合成cDNA。在ABI 7000荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行定量实时PCR，引物及探针序列见表1。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为样品标准化的内源性对照。目标基因的表达对照GAPDH的表达以计算相对定量2-ΔΔCt，并将结果表示为倍数变化。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件及GraphPad Prism 6软件进行统计分析。数据以±s的形式表达。采用Mann-Whitney检验或独立样本t检验来比较2个组之间转录因子和细胞因子的表达。Pearson相关检验用于评估PASI评分与Th1和Th2标记之间的相关性。用Spearman相关性检验以评估年龄、发病年龄、体质量、BMI、DLQI、T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-12、IL-4表达之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物及探针序列

2 结果

2.1 治疗组和对照组患者临床特征

本研究将50例银屑病患者分为2个组，对照组男17例、女8例，治疗组男15例、女10例。2个组患者的性别、年龄、体质量和BMI差异均无统计学意义（P＞0.05）。对照组和治疗组研究前PASI评分差异无统计学意义（P=0.70），治疗8周后，治疗组的PASI评分显着低于对照组（P＜0.05）。对照组的8例受试者及治疗组的12例受试者在第8周达到PASI-75（P＜0.05）。对照组与治疗组在基线时及治疗8周后DLQI差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 2个组患者临床特征比较

2.2 Th1、Th2细胞及其相关细胞因子变化

对照组中Th1细胞及其相关细胞因子IFN-γ、IL-12和T-bet的mRNA表达均高于治疗组（P＜0.01、P＜0.05和P＜0.05），见图1。以PASI-75为阈值对照组和治疗组之间的各Th1细胞因子表达差异进行研究。治疗组中PASI评分变化＞75%的受试者IFN-γ的表达低于对照组（P＜0.05），同时也有更好的临床改善。但治疗组和对照组受试者之间IL-12和T-bet的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组中IL-4和GATA3的表达高于对照组（P＜0.05），见图2。PASI评分变化＞75%的治疗组受试者GATA3及IL-4的mRNA表达高于同条件对照组受试者。Th2的GATA3及IL-4的表达与PASI评分变化之间差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，临床表现的改善与IL-4及GATA3的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图1 对照组和治疗组IFN-γ、IL-12和T-bet的相对基因表达

图2 对照组和治疗组IL-4和GATA3的相对基因表达

表3 对照组和治疗组受试者之间IL-12和T-bet表达 ±s

表3 对照组和治疗组受试者之间IL-12和T-bet表达 ±s

2.3 Th1、Th2细胞相关细胞因子变化与临床特征的相关性

IFN-γ、IL-12、T-bet、IL-4及GATA3 mRNA的表达与年龄、发病年龄、体质量、BMI及DLQI之间均无相关性（P＞0.05）。见表4。

表4 对照组和治疗组其他变量与细胞因子之间的相关性

3 讨论

T-bet和GATA-3已被发现能影响Th细胞的分化。T-bet是T-box基因中Tbr1亚家族的成员，在Th1分化中起重要作用。T-bet控制Th1IFN-γ的表达，并抑制Th2 IL-4的产生，使平衡从Th2向Th1偏移。另外，Th2途径GATA-3能促进Th2的分化及Th2相关细胞因子的表达。T-bet和GATA-3之间的相对表达会影响Th1/Th2途径，目前已在数种免疫性疾病中发现了这个现象，包括特应性皮炎、类风湿性关节炎和银屑病[7-8]。有报道提示，口服复方青黛丸会影响Th1和Th2细胞因子的表达，患者临床表现与免疫通路的特异性调节有关[9]，当平衡倾向Th2时伴随GATA3和IL-4表达的增加以及IFN-γ、IL-12和T-bet表达的减少。本研究结果与关于复方青黛丸作用的研究结果（促炎细胞因子表达降低，使平衡从Th1向Th2细胞途径偏移）[10-12]一致。

本研究发现，PASI评分变化＞75%的患者的GATA3和IL-4的表达水平高于IFN-γ、IL-12和T-bet的表达水平。因此，我们认为临床表现改善的患者常伴随Th1因子下调和Th2因子上调。相较于健康人，银屑病患者血清中IFN-γ表达更高，而IL-4表达更少，且IFN-γ水平与PASI评分相关。此外，使用复方青黛丸进行治疗后，银屑病患者血清IFN-γ水平降低的同时PASI评分也会减小。调节Th1/Th2平衡可能是通过T-bet和GATA-3介导的。有研究发现银屑病患者的PBMC中Th1细胞因子表达更显著，其中T-bet的mRNA表达高于健康人，而GATA-3的mRNA表达则低于健康人[11-13]。

综上所述，复方青黛丸可能通过加强T淋巴细胞功能、参与先天性免疫应答的一种或多种组分，或通过阻断银屑病患者炎性细胞因子的活性来增强免疫应答。复方青黛丸通过抑制银屑病患者促炎细胞因子IL-1、IFN-γ和TNF-α，同时增强Th2因子IL-4、IL-5的分泌来调节一部分免疫应答，本研究将复方青黛丸治疗银屑病的临床表现及Th1/Th2免疫模式联系起来，我们认为，复方青黛丸治疗银屑病是符合卫生经济学发展的疗法。然而，样本量较少是本研究的不足之处，相关结果需要更多样本并进行更大规模的研究数据来证实。建议进行更敏感的分析，如流式细胞术，以确定治疗后银屑病患者PBMC的相关亚群，或有助于进一步了解银屑病的免疫机制。