阿托伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌炎症及纤维化反应Notch1 信号通路、转化生长因子-β 的影响

李晓琳，刘永欣

在急性心肌梗死（AMI）病人发病过程中，炎症反应发挥着重要作用，冠状动脉斑块纤维帽破裂后，坏死的组织会释放炎性因子，引发炎症反应，致使血小板聚集，导致血栓发生，最终引发AMI［1-2］。AMI 发生后，心肌细胞缺氧、坏死，导致心肌发生纤维化改变，进而引发心肌重构［3］。此外，AMI 发生后，冠状动脉处于阻塞状态，心肌细胞缺氧、缺血而坏死，并释放出细胞内物质，导致炎症反应发生，引发心肌纤维化改变。心肌发生纤维化改变后，室壁张力增大，可加速心功能受损［4-5］。因此，对于AMI病人，临床通常会予以抗炎症反应、心肌纤维化改变方面的干预，其中，他汀类药物被广泛应用，以往研究多侧重他汀类药物对心肌炎症的作用，关于他汀类药物抗纤维化、抗炎纤维化方面机制的研究则相对较少。为进一步探讨阿托伐他汀对AMI 大鼠模型心肌炎症、纤维化改变的影响及可能机制，本研究于2017年6月至2018年1月以大鼠为对象，分为三组展开研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 （1）大鼠。选取雄性大鼠70只，购于北京维通利化实验动物技术有限公司，医学实验动物合格证号为SCXK（京）2008—0003。级别为SPF级，体质量范围为（210.23±25.76）g，圈养，饲料、水定时添加，饲养室温度控制为22～24 ℃，湿度控制为45%～55%。本研究符合一般动物试验伦理学要求。

（2）试剂与设备。阿托伐他汀购于辉瑞制药有限公司，产品批号为20160402。Masson 混合染色液：1.0 g 丽春红，0.5 g 酸性复红，150.0 mL 冰醋酸（0.25%），1.0 g 橙黄，混匀。甲苯胺蓝染色液：0.2 g甲苯胺蓝，于200.0 mL醋酸（0.2%）中溶入。苏木精-伊红（HE）染色：苏木素，A 液，于10.0 mL 无水乙醇中溶入1.0 g 苏木素；B 液，于200.0 mL 蒸馏水中溶入20.0 g硫酸铝钾；混合A液、B液，置入水浴锅中加热至沸腾，将0.5 g黄色氧化汞加入，混匀，可见溶液为深紫色后，迅速于冷水中置入，以纱布过滤，弃沉渣。使用前，于其中加入冰醋酸4.0 mL。伊红：于100.0 mL乙醇（95%）中加入1.0 g伊红，混匀，通过纱布过滤，弃沉渣。甲醛编号为100100008，甲醇编号1000141108，无水乙醇编号是10009218，均由上海国药集团化学试剂有限公司提供。1%的盐酸乙醇由100.0 mL乙醇（75%）中加入1.0 mL盐酸制取。甲醛溶液购于湖南尔康制药股份有限公司，产品批号为1 326064；Notch1 单克隆抗体购于美国CST 公司，转化生长因子-β（TGF-β）单克隆抗体购于美国abcom公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建模方法 实验前12 h，大鼠均禁食，麻醉后，于颈部、胸前进行备皮，固定大鼠头部、四肢，使其腹部朝上，消毒处理手术区域。通过镊子将颈部正中的皮肤提起，剪开，注意避开甲状腺，对颈部的肌肉展开钝性分离处理，牵拉使气管暴露，牵拉大鼠舌头使声门暴露，行气管插管予以辅助呼吸。对大鼠胸前手术区域实施消毒处理，作一横切口于左侧胸部第3、4 肋间，分离肌肉层，撑开胸腔，确定心脏位置，撕开心包膜，暴露心脏，确定左冠状动脉前降支位置，经左心耳下2～3 mm 处置入6-0 带针线穿过前降支，对前降支进行结扎，处理胸腔，缝合切口，将气管插管拔出，等待大鼠结扎。本研究共对70只大鼠进行建模，死亡4只，成功率为94.29%（66/70），最终选择较为成功的60只进行研究。

1.2.2 大鼠分组 按随机数字表法将60只大鼠分为三组。对照组：建模时仅为前降支进行分离，未结扎；AMI组：对前降支进行分离与结扎；治疗组：对前降支进行分离与结扎后，予以阿托伐他汀，10 mg/d［6］。

1.2.3 观测指标 观测指标为 （1）炎性因子：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β），（2）超声心动图检查结果，（3）病理学诊断结果，（4）Notch1蛋白、TGF-β水平。方法分别为：

（1）炎性因子及Notch1蛋白、TGF-β水平。实验后5 d，于大鼠内眦处采集血液1.0 mL，置入试管，通过离心机实施离心处理，4 000 r/min，吸取1.0 μL上层血清，保存于-80 ℃环境中。取250.0 μL 大鼠炎性因子标准品，加入等量稀释液。将250.0 μL 标准品稀释液加入EP管内，通过高浓度的标准品实施1∶1 稀释，15 min 内，分别将50.0 μL 检测缓冲液、样本加入，并于每个样本孔中加入50.0 μL的稀释液，于室温内孵育2 h，并进行6次洗涤。对辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素进行稀释后，分别加入至每个样本孔内，100.0 μL，于室温下进行45 min 孵育，洗涤6次。分别于每个样本孔中加入100.0 μL显色底物，于室温下孵育30 min，依据显色情况加入终止液，100.0 μL，30 min 内，于450 nm 波长上对吸光度（OD）值进行检测。

（2）超声心动图检查。通过Vevo2100超高分辨小动物超声影响系统实施检查，主要观察心脏形态，并测定左室射血分数（LVEF）、左室短轴短缩率（LVFS）。

（3）病理学检查。安乐死处理大鼠，取出其心脏组织，置入10%的甲醛溶液中，30 d，通过石蜡包埋处理。①HE 染色。取4 μm 的切片，通过二甲苯实施两次脱蜡处理，每次5 min，以100%的乙醇进行2 min 清洗，再分别以95%乙醇、80%乙醇清洗1 min，采用蒸馏水清洗2 min。通过苏木素进行5 min的染色处理，以自来水冲洗，于盐酸乙醇中提插30 s，置入59 ℃温水中，5 min 后取出，吸干水，置入伊红液中，2 min，于95%乙醇中浸泡2 次，每次5 min，置入100%乙醇中，浸泡1 min，置入3∶1的二甲苯石碳酸中浸泡1 min，于二甲苯中浸泡2 次，每次1 min，取出，以中性树脂进行封固。②Masson 染色。取切片4 μm，分别以自来水、蒸馏水清洗，置入Masson复合染液中，15 min，采用0.2%的醋酸进行1 min清洗，通过0.1%磷坞酸进行4 min 分化处理，以0.2%冰醋酸清洗2 次，共1 min，浸入甲苯蓝染染液中，10 s，取出以清水冲洗，以0.2%冰醋酸清洗2次，共1 min，分别以95%乙醇、无水乙醇冲洗，以二甲苯实施透明处理，采用中性的树胶进行封固。

1.3 统计学方法 本研究所涉及数据均通过SPSS 20.0 软件处理。以表示计量资料，多组间比较为单因素方差分析+多重比较LSD-t 检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组炎性因子及超声心动图检查结果比较整体分析（单因素方差分析）和多重比较（LSD-t 检验）知：各指标整体差异有统计学意义（P＜0.05）。AMI组、治疗组大鼠TNF-α、IL-1β水平高于对照组，治疗组大鼠TNF-α、IL-1β 低于AMI 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。AMI组、治疗组大鼠LVEF、LVFS均低于对照组，且治疗组高于AMI组。详见表1。实验后，AMI 组、治疗组大鼠左室室壁均较对照组变薄、运动减弱，见图1。

2.2 对比三组病理学检查结果 （1）HE 染色。HE染色下，对照组大鼠心肌细胞排列整齐，可见清晰的闰盘结构；AMI 组梗死区显著较薄，心肌细胞减少，可见纤维细胞，细胞排列紊乱；治疗组介于对照组、AMI组之间。见图2。

表1 三组大鼠炎性因子及超声心动图检查结果比较/

表1 三组大鼠炎性因子及超声心动图检查结果比较/

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白细胞介素-1β，LVEF为左室射血分数，LVFS为左室短轴短缩率。a、b分别为与对照组、AMI组相比，P＜0.05

（2）Masson 染色。对照组大鼠可见心肌组织正常，胶原纤维分布不明显；AMI组梗死区可见大量胶原纤维组织，室壁较薄；治疗组可见少量胶原纤维分布。见图3。

2.3 对比三组Notch1蛋白、TGF-β水平 AMI组、治疗组Notch1蛋白、TGF-β水平较对照组高，治疗组Notch1蛋白、TGF-β水平低于AMI组，见图4。

3 讨论

既往临床上多将AMI 归类为代谢类疾病，甚少考虑炎症病变，但在AMI病情发生、发展的整个过程中，心肌炎症反应均有参与［7］。正常情况下，心脏中有定居型、聚集型的巨噬细胞存在，AMI 发生后，定居型的巨噬细胞会增多，脾脏对聚集型巨噬细胞的释放增多，导致炎症细胞、中性粒细胞、单核细胞于梗死区聚集，引发炎症反应，导致心肌损伤速度加快［8-9］。因此，对于AMI的干预，需注重抗炎、抗心肌纤维化等方面。研究指出，AMI发生48 h后，病人血液中单核细胞会大量分泌TNF-α、IL-1β，TNF-α、IL-1β由巨噬细胞合成，可对内皮细胞黏附分子产生诱导作用，使其合成增多，致使大量炎症细胞渗入心肌梗死部位，加重心肌损伤［10］。另有研究指出，TNF-α、IL-1β过度表达可导致细胞毒性产生，导致心肌细胞重构，致使大量胶原蛋白聚集于细胞外，即发生心肌纤维化改变，进而导致心室变薄，心功能下降［11］。

本研究，AMI组、治疗组大鼠TNF-α、IL-1β水平高于对照组。提示，急性AMI 伴有心肌炎症反应。本研究AMI组、治疗组大鼠LVEF、LVFS均较对照组低。对照组大鼠心肌细胞排列整齐，心肌组织分布正常，AMI组大鼠心肌细胞减少、梗死区可见大量胶原纤维组织。本研究对大鼠进行建模时，对AMI组、治疗组大鼠前降支实施结扎处理，使前降支的血流被阻断，导致前壁发生心肌梗死，因此行超声心动图检查时，可见AMI 组、治疗组大鼠左心室的前壁变薄，心腔增大，心功能显著下降。AMI发生后3～5 d即可发生心肌纤维化改变，其改变主要经历三个过程：其一，急性期，梗死的心肌区域内大量中性粒细胞、单核细胞聚集，可清除坏死心肌细胞，巨噬细胞吞噬死亡的中性粒细胞，巨噬细胞分泌抗炎因子开抑制炎症；其二，增生阶段，受损区域有大量成纤维、血管内皮细胞迁移，可形成瘢痕；其三，瘢痕形阶段，细胞成分不断凋亡，剩余的胶原基质形成瘢痕［12-13］。因此，在病理学检查中，AMI建模后大鼠梗死区显著较薄，心肌细胞减少，可见纤维细胞，细胞排列紊乱，梗死区可见大量胶原纤维组织。进一步提示，AMI发生后，大鼠心肌会发生纤维化改变，心功能下降。

本研究予以治疗组大鼠阿托伐他汀后，治疗组TNF-α、IL-1β 均低于AMI 组。提示，阿托伐他汀可对AMI大鼠心肌炎症反应、纤维化改变产生抑制作用。托伐他汀是一种临床常用的他汀类药物，而大量临床研究表明，他汀类药物不仅具有调脂、降血压等作用，而且具有降低炎症反应、氧化应激反应、改善血管内皮细胞功能、抑制左心室重构等多方面的作用［14-15］。本研究，AMI组、治疗组Notch1蛋白、TGF-β水平较对照组高，治疗组Notch1蛋白、TGF-β水平低于AMI 组。可见，AMI 发生后，大鼠Notch1 蛋白、TGF-β水平上升，经予以阿托伐他汀干预后，Notch1蛋白、TGF-β水平下降，表明阿托伐他汀可降低水平Notch1蛋白、TGF-β水平。进一步表明，在抑制AMI大鼠心肌炎症反应、心肌纤维化改变方面，阿托伐他汀可能通过以下两个方面发挥机制：（1）阻断Notch1信号通路。炎症反应的发生与notch1信号通路紧密相关，巨噬细胞分化过程中，Notch1导致大量M1 型巨噬细胞分化，促使炎症细胞因子释放，引发炎症反应［16-17］。而阿托伐他汀可将Notch1信号通路阻断，达到抑制炎症反应的效果，从而使心肌重构减轻。（2）抑制TGF-β。TGF-β 在心肌重构、心肌纤维化改变中有重要作用，可诱导心脏成纤维细胞迁移，激活促纤维化程序，阿托伐他汀可降低TGF-β水平，达到抑制心肌重构反应、纤维化改变的作用。在AMI大鼠中，通过上述两方面的机制，阿托伐他汀可有效抑制炎症，使纤维化改变减轻，进而有效改善心功能。而阿托伐他汀抑制Notch1 信号通路、TGF-β的表达的机制可能为抑制Notch-1-TGF-β-smads 通路，使炎症、纤维化指标表达减少。

综上，AMI伴有心肌炎症反应，且心肌会发生纤维化改变，而阿托伐他汀可对心肌炎症反应基纤维化改变产生抑制作用。但本研究所选大鼠样本量不大，仍需进一步增加样本量展开研究。

图1 三组大鼠超声心动图检查结果：A为对照组；B为AMI组；C为治疗组图2 三组大鼠HE染色结果（×200）：A为对照组；B为AMI组；C为治疗组图3 三组大鼠Masson染色结果（×200）：A为对照组；B为AMI组；C为治疗组图4 三组Notch1蛋白、转化生长因子-β（TGF-β）水平（蛋白质印迹法）