人源性多肽作为乳腺癌诊断标志物的初步研究

邓奔腾，杨振淮，邱芳华，杨泽填，李东晓

我国有关癌症的健康问题日益凸显，并成为实现中国医疗基本保障的重大负担。据统计我国每年新增160 万恶性肿瘤病人，因恶性肿瘤而死亡的病人近120万人［1］。同多数国家一样，乳腺癌亦是中国女性最常见的恶性肿瘤［年龄标化率（ASR）为21.6例/10 万女性］，也是中国女性癌症死亡的第六大原因（ASR 为5.7 例/10 万女性）；我国乳腺癌女性病人的均龄为45～55 岁，且有年轻化的趋势［2］。有鉴于此，乳腺癌早期筛查和诊断的临床能力亟须提高。对于乳腺癌的早期筛查和诊断，不仅需要大众媒体的健康保健宣传，日常生活中还需增强女性病人有关乳腺自我查体的防范意识，但这靠“自摸”远远不够。临床上，早期乳腺癌的筛查缺乏肿瘤生化指标，常用的影像学检查有乳腺钼靶和高频彩超，两者各有其优缺点，临床上常常需联合使用来避免漏诊［3］。

在近年来对肿瘤发生、发展及转移的相关研究中，许多潜在的新蛋白被发现与恶性肿瘤的形成及转移有关。人源性多肽（DCD）为其中一种具有天然活性的多肽物质，由人类汗液中分离得到［4］。国外研究表明，在肝癌、结直肠癌、前列腺癌及其转移等各种肿瘤中，发现DCD可能作为一种致癌基因蛋白［4-6］。本研究通过检测DCD在乳腺癌及其癌周正常组织的表达，分析其表达情况与病例资料之间的关联。初步讨论DCD作为乳腺癌诊断生物学标志物的可能性，为乳腺癌的早期筛查及诊断提供新的方式。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选用2018 年6 月至2019 年1 月于广州中医药大学附属广州中医院乳腺外科行乳腺癌手术的切除标本48例，取各例癌组织及其癌周正常乳腺组织分为两组：实验组和对照组。同时收集和记录病人的病例资料，如年龄、绝经、临床分期、肿瘤长径、淋巴结转移、病理类型及分化程度等。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.1.1 纳入标准 （1）符合诊断：术中或术后病理学检查确诊为原发性乳腺癌且为初发者；（2）病人知情同意。

1.1.2 剔除标准 （1）乳腺癌合并其他癌症者；（2）既往病史中曾行内分泌、激素治疗或放化疗者。

1.2 蛋白质印迹法（WB）检测 收集48 例手术切除标本，含癌组织和正常组织标本。实验步骤如下。

1.2.1 总蛋白的提取 剪取约0.1 g组织样品，快速放进预冷过的匀浆器中，按1∶10比例加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液，低温下匀浆直至组织消后将样品抽到1.5 mL EP 管中，12 000×g相对离心力（RCF）、4 ℃离心10 min（冷冻高速离心机，珠海黑马，型号TGL-16R），取上清即为所提总蛋白。

1.2.2 总蛋白的保存 将提取的总蛋白加入5×上样缓冲液（2∶1），升至100 ℃持续5 min。-20 ℃保存备用。

1.2.3 WB 检测蛋白的表达 （1）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制作：①将玻璃板与制胶架组装好，挑选恰宜浓度的分离胶（参考DCD分子量），将四甲基乙二胺（TEMED）添至配置好的分离胶后马上摇匀、灌胶（留约1.5 cm的高度做浓缩胶），加入400 μL蒸馏水使分离胶面平整成直线，当水与胶之间能够看到一条很明显的折线时表明已充分凝固，接着去除胶上层水分即可。②配5%的浓缩胶，添至TEMED 后马上摇动均匀，在剩余空间内需要将浓缩胶铺满，并将梳子插入其中；浓缩胶凝固后，双手竖直轻拔出梳子的两边，将其放入电泳槽中，放置电泳缓冲液（内槽液面需高于胶），用移液器轻轻吹打每个样品孔，排出碎胶、杂物等。

（2）电泳：吸取10 μL 样品缓缓添至样品孔后，于80 V 下进行浓缩胶电泳，当指示剂跑到分离胶后，110 V恒压下指示剂即将跑出时终止仪器，取下凝胶转膜。

（3）转膜：剪取大小适合的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和4张滤纸，取前者浸于甲醇中5 min后，与滤纸、海绵共同泡在转移缓冲液中；于近极端（黑色）转移装置上依次叠放海绵、两层滤纸、胶、膜、两层滤纸、海绵；350 mA 转膜300 min（大分子样品可适当延长时间）。

（4）孵育抗体：把膜浸在封闭液中，恒温37 ℃持续1～2 h；将膜取出后直接放入一抗中，恒温37 ℃孵育1 h；洗涤液（PBST）洗膜，5 min×4次；将膜转入二抗中，恒温37 ℃孵育40 min；PBST洗膜，5 min×5次；使用化学发光法将膜显影即可。

经上述步骤后，利用Image J 软件进行WB 条带灰度分析，检测样品灰度值与内参比值。

1.3 免疫组织化学（IHC）染色 收集48 例手术切除标本，包括癌组织及癌周正常组织标本。经组织切片后脱蜡、抗原修复、3%过氧化氢室温湿盒孵育、一抗4 ℃孵育过夜、二抗室温湿盒30 min、DAB显色、苏木素复染、封片、显微镜观察及拍照等。

结果判断：DCD在癌细胞的胞质中表达，一般根据染色强度和广度进行半定量评分。具体参考HSCORE评分［7］：即在双盲下，由两名病理专业的医师分开对每张病理切片进行评定。对显微镜照片视野中的肿瘤细胞分类，分为棕褐色、棕黄色、淡黄色、蓝色四种，分别对应强阳性、阳性、弱阳性及阴性。医师需要人工扫描5 个高倍镜视野（×200），由此计算每视野中各种染色强度的肿瘤细胞百分比，根据公式计算H-score＝∑Pi（i+1），i＝0、1、2、3。将在两组的组织胞质中DCD 的表达评分值以中位数为界限，划为低表达组（0～100），高表达组（≥100～300）。

1.4 统计学方法 采用统计学软件SPSS 22.0，计数资料用χ2检验，配对设计计量资料用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WB 检测 与正常组织DCD 表达（0.641±0.482）相比，WB 检测发现癌组织中的DCD 表达（0.886±0.814）明显上调（t＝5.330，P＜0.001），具体详见图1。

图1 蛋白质印迹法（WB）检测人源性多肽（DCD）在乳腺癌癌组织（T）与正常组织（N）中的比较

2.2 IHC检测 DCD在乳腺癌组织，正常组织中有不同程度的表达；DCD 在癌组织中35 例高表达，13例低表达。而在对照组48 例正常组织中均为低表达，两组差异有统计学意义（χ2＝55.082，P＜0.001），见图2。

2.3 DCD 的表达与临床特征的关系 DCD在乳腺癌组织中的表达与其病例资料（年龄、绝经、临床分期、肿瘤长径、淋巴结转移、病理类型、分化程度等）之间无明显关联，差异无统计学意义（P＞0.05），如表1。

表1 人源性多肽（DCD）在48例乳腺癌组织中的表达与临床病例特征之间的关系/例

3 讨论

本实验初衷在于使用WB 检测、IHC 染色等方法，研究乳腺癌病人的癌组织及正常组织中DCD表达有无异同，分析其成为乳腺癌筛查及诊断的生物学标志物的可能性，为临床提高早期乳腺癌筛查和诊断的能力。本实验结果发现，与乳腺正常组织相比，在癌组织中通过WB检查、IHC染色均能有效检测出DCD的高表达，两者差异有统计学意义。初步发现DCD 有望成为乳腺癌临床诊断的生物学标志物。在前期本课题组成员邱芳华等［8］在原发性肝癌并肿瘤转移的病人中发现血清中DCD 的表达高于未转移组，而甲胎蛋白的表达水平与原发性肝癌是否出现转移无明显关联，且与单独使用血清甲胎蛋白检测相比，对于原发性肝癌联合检测DCD及甲胎蛋白的临床诊断效能更高，差异有统计学意义。因此我们提出猜想，肿瘤病人血清及癌组织中的DCD可能由癌细胞本身产生分泌，癌细胞转移过程亦可能产生分泌，这不仅仅提示DCD可成为潜在的肿瘤生物学标志物，并有望通过血清学等临床方法快速检测，补充了乳腺癌早期筛查和诊断依赖影像学的不足，方便快捷的肿瘤生化检测更有利于早期乳腺癌的筛查和诊断，值得临床推广使用。

近年来，DCD因其作为一种与肿瘤转移相关的新蛋白，一直是国外研究的热点。Brauer HA等［9］在乳腺癌病人中，发现DCD 表达水平上调；Bancovik J等［10］研究人员通过荧光原位杂交（FISH）检测初步证明了乳腺癌组织中的DCD表达与乳腺癌HER2基因扩增相关，影响其组织分化程度的分级，并且通过动物造模实验使DCD表达水平降低，减缓了癌细胞的繁殖，加快癌细胞的凋亡程序，使免疫缺陷的动物模型减少癌变的可能性，探讨了在乳腺肿瘤发生、发展及转移的过程中DCD可能作出影响的机制；Stewart GD等［11］在前列腺癌细胞中发现，在缺氧或应激等条件下DCD表达上调的比缺乏增生抑制因子（PIF）序列的癌细胞更具生存优势，说明了DCD 及PIF 的表达均可能有利于对癌细胞的生存及繁殖。

目前，国内各大研究所对于DCD 在癌症发生、发展及转移等过程中的研究较少。DCD及其功能、相关通路的机制，以及蛇葡萄素、华蟾素等祖国中草药提取物影响肿瘤发生、发展及转移等的研究为本课题组致力钻研的方向。本课题组前期在肝癌发生转移的实验中，通过体内外研究发现DCD-衔接蛋白（Nck）与肝癌及其侵袭转移的关系，明确了DCD-Nck-Wiskott-Aldrich 综合征蛋白（WASP）-肌动蛋白相关蛋白2/3复合体（Arp2/3）信号通路的形成，筛选环状RNA（circRNA）并明确其对DCD-Nck 信号通路的调控［8，12］。刘丽芳等［13］在研究蛇葡萄素对DCD-Nck信号通路的影响中发现，蛇葡萄素能有效抑制癌细胞侵袭活力，降低肿瘤基因表达，从而减缓肠癌、肝癌发生转移。本课题组将在接下来的研究中，利用IHC 染色及WB 检测等方法观察DCD，Nck，神经Wiskott-Aldrich 综合征蛋白（N-WASP），Arp2/3 这4个蛋白是否在乳腺癌组织中表达，试图研究乳腺癌的发生，剖析其转移的机制，并通过移植性人乳腺癌转移裸鼠的体内外研究，尝试解析华蟾素能否通过DCD信号通路减缓乳腺癌的发生及转移，并进一步揭示华蟾素抗癌及减缓乳腺癌侵袭转移的分子机制，为其成为有效的抗肿瘤药物提供理论基础。

综上所述，DCD 在乳腺癌组织中表达上调，因此研究DCD的表达及其信号通路在乳腺癌发生、发展及转移过程中发挥的作用，有助于我们明确乳腺癌发生及转移的机制，提高早期乳腺癌筛查和诊断的临床能力，提供乳腺癌治疗的新关键靶点。

图2 人源性多肽（DCD）在乳腺癌组织和正常组织中的表达情况（免疫组织化学染色×200）：A为正常组织；B为癌组织