血清miR-3614-5p 在妊娠期肝内胆汁淤积症诊断中的价值

赵军，孟西娜，侍佳，董蕊锐，李娜，王瑶，邹萍，张婷，许耀辉

妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是一种妊娠期特有的以皮肤瘙痒和黄疸为主要临床症状的疾病，其在中国的发生率约为4%～10%［1］。ICP 会引起较高的早产率以及胎儿窘迫、新生儿死亡等情况［2-3］。目前为止，ICP 的发病原因尚不十分清楚。总胆汁酸（TBA）是现阶段诊断ICP 的主要指标，但其仍有不足［4］。寻找一个能够及时准确诊断ICP的靶标是当前ICP治疗与监测的方向。

微小RNA（microRNA，miRNA）是长度为18～23 nt的非编码RNA序列，可参与多种生物学过程。血清miRNA 已被报道为妊娠并发症的诊断和预后生物标志物，如妊娠糖尿病和先兆子痫［5-6］。本课题组前期分析了ICP 的血清miRNA 谱并验证了部分差异表达miRNA［7］。本研究拟通过检测ICP病人血清miR-3614-5p的表达并与临床和生化参数进行相关分析，来探讨血清miR-3614-5p作为诊断ICP的候选生物标志物的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集2017 年11 月至2018 年10 月于南京医科大学附属无锡妇幼保健院妇产科就诊的ICP 孕妇79 例，均符合中华医学会制订的ICP 诊疗指南的标准（2015版）［8］。同时按随机数字表法选取就诊的健康孕妇79 例。要求各型肝炎病毒标志物均为阴性，无心、肝、肾功能异常，无临床急性或慢性疾病症状，未接受任何药物治疗。收集新鲜血液标本，且标本收集前均未做过任何治疗。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。

1.2 主要试剂与设备 RNA提取试剂盒（北京百泰克）；Prime Script TM RTⅡ逆转录试剂盒（TaKaRa，大连宝生物）；SYBR Premix Ex TaqⅡ扩增试剂盒（TaKaRa，大连宝生物）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；ABI 7500 Fast 荧光定量PCR 仪器（ABI，美国）；UV-1900紫外分光光度计（日本岛津）；Gel Doc XR+凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）；XH600电泳仪（上海昕慧）。

1.3 RNA 提取及miRNA 表达检测 血清miR-3614-5p检测采用实时荧光定量PCR（qPCR）法。分别留存两组病人静脉血样本5 mL，1 000 r/min 离心10 min，将上层血清转移至无酶管再以10 000 r/min离心10 min 吸取上层血清于无酶管－80 ℃冻存备用，按照试剂说明书，提取总RNA逆转录生成cDNA。以miR-16作为内参，采用相对定量2-ΔΔCT法计算两组标本miR-3614-5p水平［8］，以ΔCT值表示其相对表达量水平，ΔCT值越低，其相对表达量越高。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：miR-16 正向：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcgccaa-3′，反 向：5′ -GCTTGTAGCAGCACGTAAATATTG-3′；miR-3614-5p 正向：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACctgaag -3′，反 向：5′TACTAAATCGGGCAGCCTTCAG-3′。采用SYBR Premix ExTaqII 试剂盒检测每个扩增循环后SYBR Green荧光信号水平，总反应体系20 μL，反应条件：95 ℃、10 min 预变性；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 个循环。实验重复3次。

1.4 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理分析。数据不满足正态分布，以M（P25，P75）表示，组间差异分析采用Mann-WhineyU非参数检验法。对ICP组与对照组结果绘制受试者工作曲线（ROC），ROC曲线下面积（AUC）的比较采用Hanley-McNeil 非参数检验法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICP 组与对照组生化指标以及临床参数的比较 ICP 组在年龄，孕周上与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），在生化指标TBA、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平上均差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组孕妇生化指标以及临床参数的比较/M（P25，P75）

2.2 ICP 病人血清miR-3614-5p 的表达水平及与TBA 相关性 qPCR 检测结果显示，79 例ICP 病人血清miR-3614-5p的相对表达量［ΔCT：9.893（8.635，10.166）］较对照组［ΔCT：10.841（10.256，11.987）］增加，差异有统计学意义（Z＝6.00，P＝0.001）。且血清miR-3614-5p表达水平与TBA呈正相关（r＝0.311，P＜0.001），见图1。

图1 妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）病人中miR-3614-5p与总胆汁酸（TBA）的相关性

2.3 ICP 病人血清miR-3614-5p ROC 曲线分析血清miRNA-1182 在ICP 组中AUC、灵敏度、特异度分别为0.864、79.0%和83.0%，见图2。

3 讨论

图2 妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）病人血清miR-3614-5p受试者工作特征曲线（ROC）

ICP 是一种特发于妊娠中晚期，以出现瘙痒及黄疸为主要临床症状的疾病，它对母体的影响主要表现在顽固性瘙痒和易于产后出血而导致产妇死亡率增加，对胎儿的影响更甚，可导致早产、胎粪污染、新生儿窒息、新生儿死亡、新生儿神经系统后遗症等［9］。目前，ICP 的发病原因及发病机制尚不明确，大量的流行病学研究以及临床观察实验室研究认为可能与遗传、激素、基因突变、营养和环境因素有关。ICP 的诊断也没有统一标准，中华医学会制订的ICP 诊疗指南（2015 版）指出TBA 是目前诊断和检测ICP 的主要指标，但皇家妇产科医师学会（RCOG）指南并不十分认同［8］。ICP 既难以预料又无法准确监测，带给广大产科工作者巨大困惑的同时，也给孕产妇及家属带来极大的精神创伤，因此极易引起医疗纠纷。选取更灵敏和特异的指标对ICP 病人尽早进行诊断以及改善预后具有显著的意义。

microRNAs 是一类内源性的短序列非编码小分子，大量研究表明其在细胞分化、增殖和生长，细胞凋亡，血管生成，炎症等生理和病理过程中起着重要作用［10］。血清miRNA 表达稳定并易于检测，是一种非常有前景的诊断标志物［11］。自2008 年Chim 研究组首次提出循环miRNA 可作为妊娠相关并发症的生物标志物起，大量的miRNAs 被鉴定并成为妊娠疾病的生物标志物［5-6］。本研究在前期ICP 血清miRNA 谱的基础上，挑选miR-3614-5p 进行临床验证，发现其在ICP 病人中较对照组高表达，且差异有统计学意义，在ICP 孕妇组ROC 曲线下AUC、灵敏度、特异度分别为0.864、79%和83%，提示miR-3614-5p 是诊断和评估ICP 病人的理想标志物之一。

众所周知，血清TBA是胆固醇被肝脏分解后进入肝肠循环出现的物质，其代谢情况与肝脏功能障碍、实质损伤关系密切。孕中晚期雌激素波动幅度大，胆盐代谢障碍，影响肝细胞功能，进而血清TBA异常升高、肝功能指标异常，这也是血清TBA 用于检测ICP 的原理［12］。但miR-3614-5p 与ICP 的相关研究还是空白。但在生物信息学分析中，我们发现miR-3614-5p 主要调控的功能有脂质磷酸化、细胞黏附、细胞凋亡、蛋白激酶结合等，可能参与MAPK信号通路，代谢途径，Wnt 信号通路等生物过程［7］。尤其是MAPK 信号通路与脂类代谢密切相关，而脂类代谢是已明确的ICP发病机制之一。据此我们推测miR-3614-5p 在ICP 发病过程中也发挥了一定的功能作用，这还需要进一步的实验研究。

综上所述，本研究验证了ICP 病人血清中高表达的miR-3614-5p，可作为检测ICP 的一种新型靶标，具有一定的临床应用价值。