骨骼肌心磷脂酰基转移酶1的运动强度变化特征及其对氧化应激和线粒体自噬的影响

徐祖杰，田振军

氧化应激是机体各器官组织病变发生发展的主要原因。有研究报道，衰老、糖尿病、癌症及心力衰竭等机体骨骼肌中氧化应激水平显著升高，线粒体功能发生障碍（Russell et al.，2014）。线粒体是活性氧族（reactive oxygen species，ROS）产生的主要场所，当线粒体异常自噬无法清除受损的线粒体时，氧化应激水平进一步增强，二者相互作用加速骨骼肌损伤。文献资料表明，运动可通过PINK1/Parkin介导清除受损的线粒体，抑制病理条件下的骨骼肌氧化应激水平，改善线粒体功能，提高骨骼肌质量和力量（Joseph et al.，2016）。心磷脂酰基转移酶1（acyl-CoA：lysocardiolipin acyltransferase-1，ALCAT1）是定位于线粒体-内质网结构偶联的心磷脂重塑酶（Li et al.，2010），分布在心脏、肝脏和骨骼肌等组织的细胞生物膜上（Cao et al.，2004）。在肥胖、心肌肥厚、非酒精性脂肪肝和帕金森等病理模型中，心磷脂发生病态重塑，ALCAT1表达显著增加，同时氧化应激水平增强，线粒体呼吸功能下降（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。ALCAT1的下游靶标线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2，MFN2）被PINK1磷酸化后作为Parkin的受体，参与受损线粒体的清除（Li et al.，2012；Chen et al.，2013）。ALCAT1高表达后引起线粒体肿胀、断裂和呼吸功能紊乱，加速ROS产生，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬异常导致受损线粒体无法清除，诱导氧化应激水平进一步升高；靶向敲除ALCAT1后，氧化应激水平降低，线粒体呼吸功能增强，上述病理情况明显改善（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。因此，ALCAT1在氧化应激及PINK1/Parkin介导的线粒体异常自噬中发挥关键作用。

研究发现，去神经诱导大鼠骨骼肌萎缩时ALCAT1 mRNA表达增加了290%，电刺激诱导大鼠骨骼肌肥大时ALCAT1 mRNA表达下降了32%（Ostojic et al.，2013），敲除小鼠骨骼肌ALCAT1后线粒体体积增大，肌纤维直径增加（Li et al.，2010），因此，ALCAT1在骨骼肌萎缩和肥大中发挥重要作用。推测，运动训练可能是抑制ALCAT1表达和心磷脂病态重塑的有效手段（刘纽等，2017）。但目前鲜见骨骼肌ALCAT1表达变化的强度运动特征及其与氧化应激和PINK1/Parkin介导的线粒体自噬关系的相关研究。综上，本研究拟采用4周小鼠跑台运动训练，探讨骨骼肌ALCAT1在不同强度运动中的变化特征及其对氧化应激和PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的影响，为运动抑制ALCAT1重塑的强度筛选和耐力训练诱导线粒体自噬的发生机制提供实验依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象及分组

8周龄健康雄性C57BL/6J野生型小鼠32只，购于西安交通大学动物实验管理中心，动物质量合格证号：SCⅩK（陕）2017-003。所有小鼠常规分笼饲养，自由饮食进水。适应性喂养1周后，随机分为安静对照组（C组）、60%V.O2max运动强度组（SE组）、76%V.O2max运动强度组（ME组）和85%V.O2max运动强度组（HE组），每组8只。

1.2 运动方案及取材

所有运动组小鼠进行3天适应性跑台训练，速度为5 m/min，30 min/天，坡度为0°。正式运动方案的运动速度参照相关研究文献制定，SE组以8 m/min（Zhang et al.，2016）、ME 组以 12 m/min（Sonobe et al.，2015）、HE 组以18 m/min（Zhang et al.，2016）进行跑台运动，坡度均为 0°，60 min/天，5天/周×4周，C组不运动。

4周训练结束24 h后取材，颈椎脱臼处死小鼠，切取左侧腓肠肌入液氮固定，用于RT-qPCR和试剂盒检测；右侧腓肠肌一部分用于线粒体呼吸功能测定，另一部分入液氮固定，用于Western blotting实验。

1.3 生化指标测定

腓肠肌丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定，总抗氧化能力（T-AOC）含量采用比色法测定，总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行实验。

1.4 线粒体呼吸功能测定

采用Oxygraph-2k线粒体呼吸仪测定骨骼肌线粒体呼吸功能。清洗、校准工作舱，称取2 mg腓肠肌组织，冰上研磨，制备匀浆液，转移至工作舱。待呼吸速率平衡后，加入 5 μl丙酮酸、5 μl苹果酸和 10 μl谷氨酸启动态 4 呼吸。待呼吸速率再次平衡后，加入20 μl ADP启动态3呼吸。仪器记录耗氧曲线，导出数据，分析态3呼吸速率（respiration rate state 3，ST3）和态4呼吸速率（respiration rate state 4，ST4），ST3/ST4比值即为呼吸控制率比（respiratory control rates，RCR）。

1.5 Western blotting检测

取腓肠肌组织加入预冷RIPA蛋白裂解液，剪碎匀浆，离心取上清，BCA法蛋白定量。等量蛋白上样、电泳、转膜 ，5%BSA 封闭 ，孵育一抗 ALCAT1（1：1 000，Abcam#ab175516）、MFN2（1：3 000，Abcam#ab124773）、PINK1（1：1 000，Bioworld#BS8731）、Parkin（1：5 000，Abcam#ab179812）、LC3（1：1 000，Abcam#ab128025）、P62（1：600，Proteintech#18420-1-AP）、SOD1（1：1 000，GeneT-ex#GTⅩ100659）、SOD2（1：1 000，GeneTex#GTⅩ116093），4℃过夜，复温后TBST清洗5 min/次×5次，加二抗室温孵育2 h，TBST清洗5 min/次×5次，ECL发光显迹。内参为GAPDH（1：5 000，天德悦#TDY042），计算目的蛋白与内参灰度值比值即为蛋白相对表达含量。

1.6 RT-qPCR检测

采用Trizol法提取腓肠肌总RNA，严格按照TaKaRa-RNA定量和反转录试剂盒说明书进行操作，内参为GAPDH。引物序列为alcat1：F5’TGGACCGCCTAAGAGAAGGGAA 3’，R5’CGGTAACATGCAAGTTC A ATGA 3’；gapdh：F5’AATGGTGAAGGTCGGTGTG 3’，R5’GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG 3’，退火温度为60℃。

1.7 图像采集与数据处理

利用Image Lab 5.2软件采集Western blotting结果，GraphPad Prism 6.0 Demo软件作图，所有数据使用SPSS 19.0软件处理，结果以平均数±标准差（M±SD）表示，采用单因素方差分析，显著性水平选择P＜0.05和P＜0.01。

2 研究结果

2.1 不同强度运动对小鼠骨骼肌ALCAT1表达的影响

RT-qPCR和Western blotting结果显示，与C组比较，SE、ME和HE组小鼠骨骼肌ALCAT1的mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.01）；与ME组比较，HE组小鼠骨骼肌ALCAT1的mRNA和蛋白表达均显著升高（P＜0.05，P＜0.01，图1）。

图1 骨骼肌ALCAT1基因和蛋白表达结果Figure 1. Expression ofALCAT1 Gene and Protein in Skeletal Muscle

2.2 不同强度运动对小鼠骨骼肌氧化应激水平的影响

试剂盒测定结果显示，骨骼肌MDA含量：与C组比较，SE、ME和HE组均显著升高（P＜0.01），与HE组比较，SE、ME组均显著降低（P＜0.01）。T-AOC含量：与C组比较，SE、ME组均显著升高（P＜0.01），HE组无显著变化；与ME组比较，HE组显著降低（P＜0.01）。T-SOD活性：与C组比较，SE、ME组均显著升高（P＜0.01），HE组无显著变化；与ME组比较，HE组显著降低（P＜0.01，图2）。

Western blotting结果显示，骨骼肌SOD1蛋白表达：与C组比较，SE、ME组均显著升高（P＜0.01），HE组无显著变化；与ME组比较，SE、HE组均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。SOD2蛋白表达：与C组比较，SE、ME组均显著升高（P＜0.01），HE组无显著变化；与ME组比较，HE组显著降低（P＜0.01，图3）。

2.3 不同强度运动对小鼠骨骼肌线粒体自噬相关信号通路的影响

Western blotting结果显示，骨骼肌MFN2蛋白表达：与C组比较，SE、ME和HE组均显著升高（P＜0.01）；与HE组比较，SE、ME组均显著降低（P＜0.01）。PINK1和Parkin蛋白表达：与C组比较，SE、ME组均显著升高（P＜0.01），HE组无显著变化；与ME组比较，SE、HE组均显著降低（P＜0.05，P＜0.01，图 4）。提示，60%V.O2max和76%V.O2max运动强度能显著提高骨骼肌PINK1/Parkin介导的线粒体自噬水平，且76%V.O2max运动强度促进效应显著优于60%V.O2max运动强度。

图2 骨骼肌MDA含量、T-AOC含量和T-SOD活性测定结果Figure 2. Determination of MDAContent，T-AOC Content and T-SODActivity in Skeletal Muscle

图3 骨骼肌SOD1和SOD2蛋白表达结果Figure 3. Expression of SOD1 and SOD2 Protein in Skeletal Muscle

Western blotting结果显示，与C组比较，SE、ME和HE组骨骼肌LC3-Ⅱ/I比值均显著升高（P＜0.01）。与C组比较，SE、ME和HE组P62蛋白表达均显著降低（P＜0.01），与HE组比较，SE、ME组P62蛋白表达均显著升高（P＜0.01，图5）。提示，不同强度运动均可上调小鼠骨骼肌自噬流。

2.4 不同强度运动对小鼠骨骼肌线粒体呼吸功能的影响

线粒体呼吸仪测定结果显示，骨骼肌ST3和RCR：与C组比较，SE、ME和HE组均显著升高（P＜0.01）；与ME组比较，SE、HE组均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。各组之间ST4没有显著差异（图6）。提示，不同强度运动均可显著提高小鼠骨骼肌线粒体呼吸功能，其中，76%V.O2max运动强度更为显著。

2.5 骨骼肌ALCAT1蛋白表达与氧化应激和线粒体自噬相关分析

相关性分析显示，骨骼肌ALCAT1蛋白表达与MDA含量呈显著负相关（Pearson=-0.804，P＜0.01）；与SOD1蛋白表达呈显著负相关（Pearson=-0.878，P＜0.01），与SOD2蛋白表达呈显著负相关（Pearson=-0.892，P＜0.01），与PINK1蛋白表达呈显著负相关（Pearson=-0.840，P＜0.01），与Parkin蛋白表达呈显著负相关（Pearson=-0.858，P＜0.01），与 RCR 呈 显 著 负 相 关（Pearson=-0.917，P＜0.01，表1）。表明，骨骼肌ALCAT1蛋白表达与氧化应激和PINK1/Parkin介导的线粒体自噬关系密切。

3 分析与讨论

ALCAT1是参与心磷脂病理性重塑的酰基转移酶，目前只对该酶的生物学功能进行了初步研究。文献表明，ALCAT1能调控线粒体呼吸功能（Li et al.，2012；Song et al.，2019）、氧化应激（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Wang et al.，2015；）和磷酸肌醇水平（Bone et al.，2017）。在肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝和帕金森等疾病模型中，ALCAT1表达显著升高，诱导线粒体呼吸功能紊乱、胰岛素抵抗和氧化应激损伤（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。在 ALCAT1 过表达的C2C12细胞系中，脂质过氧化产物MDA含量显著增加，编码氧化应激的基因NADPH氧化酶4（NOⅩ4）的mRNA表达显著升高，而编码抗氧化酶的基因如谷胱甘肽过氧化物酶（GPⅩ）、过氧化还原酶（PRDⅩ）、硫氧还蛋白还原酶（TⅩNRD）和超氧化物歧化酶（SOD）的mRNA表达显著降低；使用H2O2处理小鼠分离的原代骨骼肌细胞后，ALCAT1表达显著增加（Li et al.，2010）。以上研究提示，ALCAT1和氧化应激存在互作关系（Shi，2010）。有研究表明，ALCAT1低表达或敲除能减轻病理条件下氧化应激水平，上调PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，改善线粒体呼吸功能（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。Li等（2010）提出，抑制ALCAT1表达可能成为肥胖和其他代谢疾病的潜在治疗靶点。有研究认为，运动训练可能是抑制ALCAT1表达的有效手段（刘纽等，2017），但缺乏相关实验支持。因此，本研究采取不同强度耐力运动，探讨骨骼肌ALCAT1在不同强度运动中的变化特征。

图4 骨骼肌MFN2、PINK1和Parkin蛋白表达结果Figure 4. Expression of MFN2，PINK1 and Parkin Protein in Skeletal Muscle

图5 骨骼肌LC3和P62蛋白表达结果Figure 5. Expression of LC3 and P62 Protein in Skeletal Muscle

本研究发现，经过4周不同强度的耐力训练，小鼠骨骼肌ALCAT1的mRNA和蛋白表达均显著降低。同时，与ME组比较，SE组小鼠ALCAT1的mRNA和蛋白表达虽有降低趋势但无显著性，HE组小鼠ALCAT1mRNA和蛋白表达却显著增加。表明，骨骼肌ALCAT1表达变化呈现明显的运动强度特征，抑制ALCAT1表达的最佳运动强度可能在76%～85%V.O2max。本研究还发现，4周60%、76%V.O2max运动强度跑台训练能显著增加小鼠骨骼肌MDA含量、T-AOC含量、T-SOD活性、SOD1和SOD2蛋白表达；但在85%V.O2max运动强度组中，以上抗氧化能力指标无显著变化，MDA含量却异常升高。表明，适宜强度的耐力运动能刺激骨骼肌氧化产物和抗氧化酶的生成，激活氧化-抗氧化系统，而大强度运动则会显著提高氧化应激水平，对抗氧化能力无显著影响。值得关注的是，有研究显示，病理条件下ALCAT1与MDA相互调节（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。本研究结果表明，4周运动训练后骨骼肌ALCAT1蛋白水平与MDA含量呈显著负相关，提示，运动调控ALCAT1表达与氧化应激水平关系密切，运动产生的有益生理效应与病理条件下应激反应的差异性可能是造成这一结果的主要原因，其具体生物学分子机制仍需进一步研究。线粒体生物能学结果显示，不同强度运动后骨骼肌ST3和RCR均显著升高，ST4无显著差异。但与ME组比较，HE组小鼠ST3和RCR却显著下降，其趋势与ALCAT1表达一致。推测大强度运动导致骨骼肌出现氧化应激损伤，进而诱导线粒体质子漏和呼吸链解偶联，线粒体呼吸功能有所下降。

线粒体是能量转换和生物氧化的主要场所，有细胞“能量工厂”之称。线粒体在氧化磷酸化过程中会产生ROS等副产物，引发细胞氧化应激；过度累积的ROS又会将线粒体作为攻击靶标，损伤线粒体结构和功能（Hara et al.，2018）。与此同时，ROS能激活线粒体自噬以清除受损的线粒体，降低氧化应激水平，维持内环境稳态（Zhao et al.，2018）。心磷脂是线粒体氧化磷酸化的关键磷脂，ROS能氧化心磷脂的双键结构，引起心磷脂病理性重塑，导致线粒体功能紊乱（Paradies et al.，2014）。ALCAT1催化心磷脂的病理性重塑，诱导氧化应激和线粒体功能障碍。文献报道，MFN2为ALCAT1介导的线粒体功能障碍的下游靶标，在去极化的线粒体中PINK1磷酸化MFN2，吸引并结合Parkin促进线粒体自噬以清除受损的线粒体（Chen et al.，2013；Li et al.，2012）。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3）是反映自噬体形成的特异性标记物，它在细胞中有两种相互转化的形式即LC3-I和LC3-Ⅱ，目前研究中多利用LC3-Ⅱ/I比值反映自噬体的数量。P62（Protein 62）作为选择性自噬受体，能介导LC3-Ⅱ与自噬体膜的连接，并通过自噬降解。因此，当LC3-Ⅱ/I比值与P62的降低具有一致性时，表明自噬流通畅，自噬流是评价自噬水平的可靠指标（Parousis et al.，2018）。有研究比较了久坐不动和经过耐力训练的健康受试者股外侧肌线粒体自噬相关蛋白表达，结果显示，耐力训练后MFN2、PINK1、Parkin和LC3蛋白表达显著升高，P62表达没有显著变化，骨骼肌代谢和线粒体功能增强（Tarpey et al.，2017）。长跑运动员进行一次极限耐力运动后，肌肉活检结果显示，骨骼肌LC3-II表达显著增加，PINK1和Parkin表达没有显著变化（Jamart et al.，2012）。动物实验研究发现，一次大强度离心运动后，大鼠骨骼肌有大量自噬体形成，PINK1、Parkin和LC3蛋白表达均显著升高，提示，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在运动性骨骼肌损伤中发挥重要作用（尚画雨等，2018）。6周耐力训练可显著上调肥胖小鼠腓肠肌PINK1 mRNA和蛋白表达及LC3-Ⅱ/I比值，下调P62蛋白表达，从而提高骨骼肌线粒体数量，改善线粒体功能（崔迪等，2014）。然而另有研究报道，8周游泳耐力训练后，虽然小鼠骨骼肌MFN2蛋白表达显著升高，但PINK1、Parkin蛋白表达以及LC3-Ⅱ/I比值均无显著变化，P62蛋白表达显著下降（Ju et al.，2016）。由此可见，运动调控骨骼肌PINK1/Parkin介导的线粒体自噬可能受运动形式和运动强度的影响。

图6 骨骼肌线粒体呼吸功能测定结果Figure 6. Measurement of Mitochondrial Respiration Function in Skeletal Muscle

表1 ALCAT1蛋白表达与氧化应激和线粒体自噬相关分析Table 1 Correlation Analysis of ALCAT1 Protein Expression with Oxidative Stress and Mitochondrial Autophag n=16

本研究结果发现，4周60%V.O2max和76%V.O2max运动强度耐力训练可显著提高小鼠骨骼肌MFN2、PINK1和Parkin蛋白表达以及LC3-Ⅱ/I比值，降低P62表达，表明，适宜强度运动能促进骨骼肌PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。值得关注的是，经过85%V.O2max运动强度的耐力训练后，骨骼肌MFN2表达以及LC3-Ⅱ/I比值升高，P62表达降低，提示自噬流通畅，但PINK1和Parkin的蛋白表达却无显著变化，表明，85%V.O2max运动强度的耐力训练对骨骼肌PINK1/Parkin介导的线粒体自噬无显著影响。原因分析：1）85%V.O2max强度运动提高了骨骼肌线粒体功能适应性，线粒体自噬水平趋于稳定；2）85%V.O2max强度运动诱导的线粒体自噬可能不依赖于PINK1/Parkin通路，其他线粒体自噬途径如NIⅩ/BNIP3通路可能参与了此过程的线粒体自噬（Dun et al.，2017），但具体机制有待进一步研究。此外，本研究结果显示，骨骼肌ALCAT1蛋白水平与PINK1、Parkin和RCR呈显著负相关，推测运动抑制骨骼肌ALCAT1重塑可能与PINK1/Parkin介导的线粒体自噬有关，但具体机制尚不明确。进一步采用ALCAT1敲除及过表达动物模型，探讨ALCAT1在不同强度运动调控骨骼肌氧化应激和PINK1/Parkin介导的线粒体自噬中的作用及其具体机制，将为运动介导骨骼肌功能稳态提供新的视角和依据。

4 结论

骨骼肌ALCAT1表达变化呈现明显的运动强度特征，4周不同强度运动均可抑制骨骼肌ALCAT1表达，提高线粒体呼吸功能，其中76%V.O2max运动强度效果更显著。