金针菇与杏鲍菇混合发酵条件的探究

罗青，杨玉珍，王国霞，陈刚

(郑州师范学院 生命科学学院，郑州 450044)

随着人们生活水平的提高及消费观念的转变，食用菌的营养和健康价值逐渐受到人们的关注，从食用菌出发进行复合调味品的研究也逐渐增多[1]。

在诸多食用菌中，金针菇与杏鲍菇是两种常见且应用广泛的菌类。金针菇又名朴菇，隶属于真菌门，担子菌亚门，层菌目，口蘑科，金钱菌属。它被称之为智力菇，因其中所含赖氨酸和精氨酸比较多，分别达1.024%和1.231%[2]，可以促进儿童的智力发育。杏鲍菇又称刺芹侧耳，其中所含精氨酸和谷氨酸含量很高，同时，这两种菌类都具有促进肠胃消化,降血脂,降低胆固醇,防止心血管疾病,增强机体免疫能力,抗氧化,抗病毒等药用功效[3,4]。其中金针菇多糖是金针菇中所含的主要有效生物活性成分，它具有抑制肿瘤、抗癌和增强机体免疫力等作用[5]，同样在杏鲍菇中也含有丰富的多糖类物质，具有降血糖和非常强的免疫调节作用[6,7]。因此，可以将两种菌类在食品、调味品等工业中加以应用，如功能型调味品的开发，会有广阔的应用前景。

目前食用菌功能型复合调味品可利用菌丝体发酵液做成调味汁[8]，但大多采用的都是单一食用菌，如香菇酱油、草菇老抽等[9]，而将两种或两种以上的食用菌用于调味品的发酵生产还很少见[10]。混合发酵是指采用两种或多种微生物在协同作用下共同完成某发酵过程。目前在食用菌方面进行混合发酵的研究还较少，其中苗敬芝等[11]曾研究过灵芝和金针菇混合发酵-芦荟复合保健饮料，结果表明，保健饮料口感好，营养也比较全面，远高于纯种发酵。食用菌的混合发酵也将会加大应用研究[12]。本课题试验将对金针菇和杏鲍菇这两种大型真菌的菌丝体进行混合发酵培养，优化混合发酵的培养基成分和培养条件，并对两者混合发酵液多糖产生情况进行探究，可为金针菇和杏鲍菇功能型复合调味品产品的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌种

杏鲍菇母种；金针菇母种，生命科学学院微生物实验室分离保存。

1.1.2 试验试剂

马铃薯(超市购买)；葡萄糖、麦芽糖、淀粉、蔗糖、果糖(均为分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；蛋白胨、黄豆粉、酵母粉(均为生化试剂)：北京奥博星生物技术有限责任公司；NaNO3、NH4NO3、Na2SO4、MgSO4、K2SO4、FeSO4、CuSO4、KH2PO4(均为分析纯)：天津市凤船化学试剂科技有限公司；蒽酮、80%硫酸(均为分析纯)：上海展云化工有限公司。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)：去皮马铃薯200 g；葡萄糖20 g；琼脂20 g；自来水1000 mL；pH自然。

液体发酵培养基：马铃薯200 g；碳源20 g；氮源20 g；KH2PO42 g；无机盐1 g；清水10000 mL；pH自然。

所有培养基经高压灭菌，121 ℃，20 min。

1.2 仪器与设备

DRP-9052电热恒温培养箱 常州市赛维思环境试验设备有限公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械有限公司；SW-CJ-2G超净工作台 苏州市安泰空气技术有限公司；TS-100B恒温摇床 上海安竞实验设备有限公司；T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 金针菇、杏鲍菇菌种活化

将金针菇和杏鲍菇的试管菌种挑取1环接种到新鲜的PDA平板培养基上，于26 ℃培养箱中培养72 h，待菌丝长出备用。

1.3.2 菌丝体量的测定

将发酵液用滤纸过滤留菌丝体于滤纸上，自然晾干菌丝团明水后于电子天平上称重。

1.3.3 单因素试验——混合发酵培养基碳源的优化

在液体发酵培养基中保持其他成分不变，分别加入葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉5种不同的碳源[13]，严格按照无菌操作，用镊子各取1 cm正方形大小的杏鲍菇和金针菇菌丝块接入液体发酵培养基中，再做两组各自单独接入金针菇和杏鲍菇菌丝块作为对照。每组3个重复。放置到110 r/min摇床于26 ℃培养，每隔7 d进行菌丝重量测量，培养21 d后对其发酵液进行多糖含量测定。根据菌丝量变化和多糖含量变化确定最佳碳源。

1.3.4 单因素试验——混合发酵培养基氮源的优化

在确定最适碳源营养后，发酵液中其他成分不变，将培养基中的氮源分别添加蛋白胨、NaNO3、NH4NO3、黄豆粉、酵母粉10 g[14]，同1.3.3法接种培养和测定，筛选出金针菇杏鲍菇混合发酵的最佳氮源。

1.3.5 单因素试验——混合发酵培养基无机盐的优化

同1.3.3方法培养分别添加NaSO4、MgSO4、K2SO4、FeSO4、CuSO4作为无机盐参考，筛选出金针菇杏鲍菇混合发酵的最佳无机盐营养。

1.3.6 单因素试验——混合发酵条件温度的优化

将培养温度分别设定在20,22,24,26,28 ℃，根据菌丝生长量和多糖浓度，筛选出金针菇杏鲍菇混合发酵的最佳温度。

1.3.7 单因素试验——混合发酵条件转速的优化

将金针菇杏鲍菇发酵液培养转速设置为70,90,110,130,150 r/min 5个梯度进行培养，根据菌丝生长量和多糖浓度，筛选出金针菇杏鲍菇混合发酵的最佳转速。

1.3.8 多糖浓度测定

分别取0.1 g/L的葡萄糖溶液0.01,0.02,0.03,0.04,0.06,0.08,0.1,0.12 mL用蒸馏水补至1 mL，分别加入6 mL蒽酮试剂，每个试管加完之后一起浸入沸水浴中，试管口加上盖子以防止蒸发。沸水浴15 min取出，用自来水冷却，于620 nm比色。以同样处理的重蒸馏水为空白，进行比色，以糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，得标准曲线y=5.7433x+0.0097,R2=0.9956，见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

取样品1 mL，加入6 mL蒽酮试剂，同标准曲线操作，比色测定，根据标准曲线方程计算含量。

1.3.9 正交试验

将单因素试验所得的最佳碳源、氮源、无机盐，采用三因素三水平进行L9(33)正交试验[15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同碳源对混合菌丝的生长影响

(a)蔗糖

(b)果糖

(c)麦芽糖

(d)葡萄糖

(e)淀粉

(f)碳源

由图2可知，不同碳源对混合发酵及单独菌液发酵的影响中，麦芽糖、蔗糖为碳源时对菌丝生长影响最大，菌丝重量增加最显著，21 d培养菌丝重量达到(7.32±0.39) g，综合其影响的显著性,各碳源的影响排列顺序为麦芽糖>蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉，而且数据明显表明混合发酵的菌丝增加量要比纯种发酵菌丝生长增加量高。

2.1.2 不同氮源对混合菌丝生长的影响

(a)黄豆粉

(b)蛋白胨

(c)酵母粉

(d)NH4NO3

(e)NaNO3

(f)氮源

由图3可知，不同氮源对混合发酵和纯种发酵的影响皆有不同，混合发酵菌丝生长的比较快，其中蛋白胨对菌丝的生长速率影响最大，21 d培养菌丝重量达(6.31±0.25) g，以蛋白胨为氮源时混合发酵的菌丝重量增加最大，其次是黄豆粉和NH4NO3，两者差别不太大。综合各种氮源的影响排列顺序为蛋白胨>黄豆粉>NH4NO3>酵母粉>NaNO3。

2.1.3 不同无机盐对混合菌丝生长的影响

(a)FeSO4

(b)CuSO4

(c)K2SO4

(d)Na2SO4

(e)MgSO4

(f)无机盐

由图4可知，不同无机盐对混合发酵和纯种发酵的影响也各有不同，同样是混合发酵的菌丝生长量要比纯种发酵快，其中FeSO4对菌丝的生长速率影响最大，21 d培养菌丝重量达(7.32±0.05)g，各种无机盐对菌丝的生长影响的主次顺序为FeSO4>K2SO4>CuSO4>MgSO4>Na2SO4。

2.1.4 温度对混合发酵液的影响

(a)20 ℃

(b)22 ℃

(c)24 ℃

(d)26 ℃

(e)28 ℃

(f)温度

由图5可知，不同温度对混合发酵的影响要比纯种发酵的影响大，其中在26 ℃时菌丝的生长最快，21 d培养菌丝重量达(5.88±0.32) g，两边均呈下降趋势，分析其原因发现低温条件下菌丝生长缓慢，而温度过高也会抑制菌丝的生长[16]。

2.1.5 转速对混合发酵液的影响

(a)70 r/min

(b)90 r/min

(c)110 r/min

(d)130 r/min

(e)150 r/min

(f)转速

由图6可知，不同转速对混合发酵种菌丝生长的影响也要比纯种发酵的影响大，其中转速为110 r/min时菌丝的生长速率最大，21 d培养菌丝重量达(6.11±0.17) g。在摇床过程中高转速会导致菌丝过密[17]，且容易污染，相反，低转速又会影响营养物质的传导和溶氧量，不利于混合菌丝的生长[18]。

2.2 多糖浓度测定结果

(a) 不同碳源发酵液的多糖浓度

(b) 不同氮源发酵液的多糖浓度

(c) 不同无机盐发酵液的多糖浓度

(d) 不同温度发酵液的多糖浓度

(e) 不同转速发酵液的多糖浓度

由图7可知，金针菇和杏鲍菇混合发酵液的多糖浓度大部分是高于其纯种发酵液含量的，由图7各条件下多糖的浓度可以看出菌丝的最高生长量与多糖最大浓度并不统一，如果以多糖浓度为参考指标，发酵液产出多糖浓度最高的条件为：碳源为果糖时多糖浓度最高为(3.08±0.03)%，氮源为蛋白胨时多糖浓度最高为(3.21±0.02)%，无机盐为MgSO4时多糖浓度最高为(3.39±0.09)%，温度为26 ℃时多糖浓度最高为(3.39±0.01)%，转速为130 r/min时多糖浓度最高为(3.39±0.03)%。

2.3 正交试验结果分析

正交试验因素水平见表1，结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment %

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可知不同碳源比例对混合发酵中菌丝的生长有很大的影响，根据极差分析结果得出，碳源在整个实验因素中影响最大，其次为氮源，最后是无机盐，碳源和氮源很接近。比较K值可得出最佳配方A2B2C2，即碳源果糖含量为2%、氮源蛋白胨含量为2%、无机盐MgSO4含量为0.5%。

3 结论与讨论

通过不同碳源、氮源、温度、转速、无机盐的筛选，得到金针菇与杏鲍菇混合发酵菌丝生长量最高的条件：麦芽糖为碳源，蛋白胨为氮源，无机盐为FeSO4，温度为26 ℃，转速为110 r/min。金针菇与杏鲍菇混合发酵多糖含量最高的发酵条件：果糖为碳源，蛋白胨为氮源，无机盐为MgSO4，温度为26 ℃，转速为130 r/min。本研究表明混合发酵生长效果要比纯种发酵生长速度快多，发酵液多糖含量混合菌也要高于纯种发酵的多糖含量。

本试验利用金针菇和杏鲍菇混合液体发酵培养的互利协同作用，很大地提高了金针菇和杏鲍菇单一发酵的生产价值，可以在食用菌复合调味品的研究中进行应用，其中多糖含量的增加可以进一步提高调味品的保健功能[19]，而发酵速度的增加可以缩短调味品生产发酵周期。该试验研究为今后食用菌相关食品、调味品工业等方面的开发利用提供了新的技术支持。