腊八豆挥发性风味物质的研究

王嘉瑞，李青卓，胡文康，孙莉，汪超，徐宁

(湖北工业大学 生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心,武汉 430068)

腊八豆作为一种典型的发酵豆类食品，是中国传统美食之一。多在冬至后制作,至腊月初八起食用,故称腊八豆。现代生产腊八豆的工艺以新鲜的黄豆为原料，辅以花椒、盐为佐料，经过蒸煮，接种纯种毛霉，密封厌氧发酵。腊八豆富含氨基酸、维生素、功能性短肽、大豆异黄酮等生理活性物质，具有很好的保健功效，又因为其味道鲜香辣，回味绵长，深受人们的喜爱。

随着人们生活品质的提高，不管是对食品的色、香、味，还是对其营养物质含量均有一定的要求。对于传统发酵食品，微生物菌种、底物调控和发酵工艺均是影响其风味物质的重要因素。风味物质是影响腊八豆品质的一个重要指标，大部分风味物质是微生物在发酵过程中，通过不同的代谢途径利用原料中的脂肪、淀粉、蛋白质经微生物酶水解后产生的各类次级产物与小分子风味成分[1]。

食品中的挥发性风味物质成分往往种类多，含量低，且复杂不稳定，提取过程中还容易受外界条件影响，所以其分析结果的准确性很大程度上取决于香气物质的提取方式。选择合适的研究分析方法来鉴别特征风味物质的组成，对产品的研制和生产具有重要意义，同时对于发酵豆酱类产品的后期香味调控也有一定的意义。

目前国内外对中国豆豉风味的研究很少,尤其是对曲霉豆豉风味的研究还处于起步阶段。欧阳晶等用SPME-GC-MS技术对低温发酵腊八豆挥发性成分随时间变化做过相关研究，因为方法限制，无法得到各挥发性成分的香气活性值，因此无法确定各组分化合物对腊八豆风味的影响[2]。对于不同的品牌和不同的提取方法检测腊八豆风味成分的报道还比较少见。

同时蒸馏萃取法(simultaneous distillation extraction,SDE)和固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)是两种常见的香气提取方法[3]。SDE法测定范围较宽，可用来提取挥发性、半挥发性风味成分，但主要以高沸点化合物为主，且其部分成分可能是由于高温导致了某些化学反应转变而来的挥发性物质；HS-SPME法比较灵敏，无溶剂且方便易行，可缩短分析时间，但萃取头只能选择性吸附一部分挥发性成分。

本文采用两种不同的挥发性物质提取方法SDE法和HS-SPME法经GC-MS检测分析了腊八豆挥发性风味成分，比较两种方法提取4种腊八豆挥发性成分的差异和特征，为腊八豆产品的风味物质定性提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腊八豆样品：湖南长沙锦程香辣腊八豆(JC)、湖南益阳辣妹子原味腊八豆(LMZ)、湖南长沙田野故事香辣腊八豆(TYGS)、湖北宜昌土道家腊八豆(TDJ)；氯化钠、二氯甲烷、无水硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司。

SPME手动进样手柄及萃取头(CAR/PDMS) 美国Supelco公司；Agilent GC-MS 7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；HH-8CJ数显磁力搅拌恒温水浴锅 常州市金坛友联仪器研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

用纱布将腊八豆的油过滤除去，用研钵将腊八豆研碎，作为待测试样。

1.2.2 SDE法条件

称取腊八豆研碎样100 g置于同时蒸馏萃取装置的500 mL圆底烧瓶中，加入200 mL去离子水，加入沸石，用电热套加热。另一侧在250 mL圆底烧瓶中加入二氯甲烷50 mL，用45 ℃水浴加热，置于同时蒸馏萃取装置重相一端。两边同时微沸开始计时，保持沸腾2 h。停止加热后，取下装有二氯甲烷的烧瓶缓缓打开旋塞回收装置中的二氯甲烷。置于-20 ℃冰箱中冷冻过夜脱水，用滤纸过滤，并继续用无水硫酸钠过滤除水。随后用韦氏分馏柱浓缩，55 ℃水浴加热，控制分流比约30滴/min，待瓶内的液体少于5 mL时，停止加热，静置使柱内溶剂滴下来，转入10 mL离心管，用氮吹仪氮吹浓缩除去大部分二氯甲烷溶剂至2 mL，再过膜转入溶剂瓶中，供GC-MS分析鉴定。

1.2.3 HS-SPME法条件

将固相微萃取头在气相色谱仪的进样口经270 ℃老化1 h备用；称取1.2.1中的研碎样品5 g，放入20 mL顶空瓶中，加入5 mL去离子水和1 g NaCl，加入磁力搅拌转子，密封瓶口；将其置于60 ℃的恒温水浴锅内磁力搅拌平衡30 min；然后将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，推出萃取头离液面1 cm处，吸附30 min后取出，随即插入仪器的进样口，于270 ℃解吸3 min，进行数据采集分析。

1.2.4 GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱DB-35 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气(纯度>99.999%)，进样口温度270 ℃，柱流速1 mL/min，不分流进样；升温程序：起始温度为40 ℃,保持5 min，以6 ℃/min升到85 ℃，保持1.5 min，再以2.5 ℃/min升到150 ℃，保持1 min，最后按20 ℃/min升到280 ℃，保持1 min。质谱条件：离子源EI；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子轰击能量70 eV，质量扫描范围25～450 amu。

2 结果与分析

发酵大豆制品的原材料、发酵工艺[4]和接种微生物[5]均能对其产品风味产生很大影响。在微生物生长的过程中分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶酶系，能够将原料中的营养物质水解成脂肪酸、短肽、氨基酸等,进而生产大量相应杂环类、醛类、酮类等风味化合物。其次腊八豆后发酵过程中加入的生姜中所含的莰烯、α-姜黄烯等挥发性成分[6]，以及大蒜中的含硫化合物等也是腊八豆风味的重要成分[7]。

2.1 两种挥发性物质提取方法的比较

本试验通过SDE法和HS-SPME法两种方法对4种品牌腊八豆样品进行挥发性风味成分的检测和分析，相对峰面积≥1%的挥发性风味物质检测结果见表1，总共鉴定出115种物质，其中SDE法共检测出98种物质，HS-SPME法共检测出73种物质，这些化合物主要分为10类，包括醇类12种，醛类15种，酮类6种，醚类7种，酚类5种，酸类4种，酯类17种，烷烃类40种，含硫类4种和杂环类5种。

表1 两种不同提取方法检测四种不同品牌腊八豆的挥发性风味物质相对含量Table 1 Two different extraction methods for detecting the relative content of volatile flavor compounds in four different brands of fermented soybeans

续 表

续 表

续 表

SDE法鉴定出4种腊八豆样品中各类化合物的相对含量见图1，这些香气成分分别占总峰面积的94.4%、87.51%、89.64%、84.52%。共鉴定出物质98种，包括醇类12种，醛类13种，酮类5种，醚类6种，酚类3种，酸类3种，酯类14种，烷烃类34种，含硫类3种和杂环类5种。

图1 SDE提取腊八豆挥发性风味物质相对含量Fig.1 The relative content of volatile flavor compounds extracted from fermented soybeans by SDE

HS-SPME法鉴定出4种腊八豆样品中各类化合物的相对含量见图2，这些香气成分分别占总峰面积的75.22%、76.41%、77.02%、77.15%。共鉴定出物质73种，包括醇类8种，醛类5种，酮类3种，醚类6种，酚类4种，酸类2种，酯类7种，烷烃类31种，含硫类3种和杂环类4种。分析结果表明，SDE法比HS-SPME法能较好地检测出腊八豆中的挥发性风味物质，特别是醇类、醛类和酯类物质。

图2 HS-SPME提取腊八豆挥发性风味物质相对含量Fig.2 The relative content of volatile flavor compounds extracted from fermented soybeans by HS-SPME

大多数挥发物质在两种方法(SDE法和HS-SPME法)中都能检测到，但是某些物质只被其中一种方法检测到，如正己醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、棕榈酸、十四酸乙酯、亚油酸乙酯、硬脂酸乙酯、姜烯、(S)-β-红没药烯、β-倍半水芹烯等物质仅在SDE法中被检测到；丁香酚、4-异丙基环己烷-1,3-二烯甲醛、(+)-γ-古芸烯、二十二烷、二十八烷等物质仅在HS-SPME法中被检测到。两种方法结合能够更好地检测出腊八豆中挥发性风味物质。

2.2 腊八豆中主要挥发性风味物质

4种腊八豆样品中，JC样品、LMZ样品、TYGS样品、TDJ样品分别鉴定出73种、66种、77种和77种挥发性物质，检出次数较多且含量较丰富的物质有芳樟醇、2-茨醇、1-辛烯-3-醇、柠檬醛、甲基庚烯酮、茴香脑、乙基麦芽酚、棕榈酸乙酯、蒎烯、莰烯、桧烯、α-姜黄烯、正二十烷、正二十一烷、烯丙基二硫等。JC样品的SDE法检测出了较高的醇类物质，主要是芳樟醇含量很高；HS-SPME法检测出的乙基麦芽酚含量很高，未检测出酯类物质。LMZ样品在4种样品中烷烃类物质和酯类物质占比最大，用SDE法未鉴定出醚类。TYGS样品相对于其他样品含有较多的含硫类物质和杂环类物质。TDJ样品中杂环类物质较其他样品含量最多，且用HS-SPME法检测出的酯类物质和烷烃类物质较其他样品均较少。

2.2.1 醇类化合物

不饱和醇的阈值相对于直链饱和醇的阈值相对较低，对风味的形成有较大的贡献作用[8]。1-辛烯-3-醇天然存在于蘑菇、甜瓜、茶叶、麦芽中[9]，具有草药味和蘑菇香；2-茨醇又被称为冰片，有类似樟脑气味；桉叶油醇具有樟脑气息和清凉的草药味道；香茅醇具有玫瑰样气味等；芳樟醇具有花香与木香；4-萜烯醇呈暖的胡椒香、较淡的泥土香和陈腐的木材气息；α-松油醇具似海桐花的清香，甜的紫丁香、铃兰气息[10]，各种醇香相互调和，赋予了腊八豆特有的风味特征[11]。醇类对其他物质还具有调香作用，如与酸反应生成酯类。醇是形成多种物质的前体物质，同时醇也可以使产品具备微甜醇厚的风味，是极为重要的风味物质与风味前体物质之一[12]。

2.2.2 醛、酮类化合物

醛类的阈值较低，给予食物清香和果香的芳香特质，微量的醛可在香气中起到调和的作用。在发酵过程中，醛类化合物可以通过脂质过氧化和降解产生[13]，也可以通过氨基酸的Strecker降解产生，也有部分是醛酸途径的产物。在腊八豆样品中含量较高的有糠醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、橙花醛、柠檬醛等。糠醛、苯甲醛有特殊的杏仁气味，苯乙醛具有风信子香气，可用于调配草莓和樱桃等香精，也能够赋予酱甜香和水果样的香气。直链醛类化合物主要是由脂肪氧化降解产生的，具有6个碳原子以上的醛类是脂肪氧化的典型产物[14]。4-异丙基苯甲醛可用作香料，少量用于金合欢、紫罗兰、风倍子、紫丁香、铃兰等香型的香精中；(E,E)-2,4-庚二烯醛是典型的亚油酸氧化产物，有桔子和甜橙的香气，带有脂肪气息[15]，主要用于配制鸡肉香精及土豆片、柑橘、油炸品和香辛型食品。

酮类物质大多是脂肪氧化和Maillard反应的产物，一般认为酮类物质具有清香味、奶油气味和果香味。本实验检测出的酮类物质共有6种，3-乙酰基-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮含量较高，甲基庚烯酮具有柠檬草的香气，在大多数样品中都能检测到。酮类物质阈值较醛类物质高，且检测出的酮类物质含量和种类均较少，对腊八豆的贡献可能相对较小。

2.2.3 醚、酚类化合物

虽然醚类化合物的相对含量比较低，但其对腊八豆香味成分的贡献不容忽略。其中，含量相对较高的烯丙基甲基二硫醚有茴香和草香香气，有增加香味的效果。二烯丙基三硫醚具有大蒜味与冲鼻气味。

发酵豆制品中的酚类物质虽然含量极微，但作为香气成分作用十分明显，很容易被察觉[16]。检出的酚类如乙基麦芽酚具有持久的焦糖和水果香气，是一种食品添加剂，丁香酚有像丁香的气味，2,4-二叔丁基苯酚是一种增塑剂。

2.2.4 酸类化合物

在腊八豆样品中共检测出4种酸类，分别是2-氨基-5-甲基苯甲酸、脱氢乙酸、棕榈酸和亚油酸。脱氢乙酸可能是由乙酸脱氢生成，乙酸还可以合成乙酸酯类物质，增加腊八豆香气，有机酸可以调节食物味道，使整体味道更加柔和[17]。微生物生长分泌的酶可以将大豆中油脂分解成长链脂肪酸，脂肪酸本身氧化降解和氨基酸降解后经氧化或还原作用可以生成低级酸类物质，酸类物质具有刺激性气味，能调和腊八豆的风味[18]。

2.2.5 酯类化合物

酯类化合物是传统发酵豆酱香气不可缺少的重要组成部分。酯类化合物多数由细菌产生的有机酸和酵母产生的醇在酯化酶的催化下形成[19]。如乳酸乙酯、己酸乙酯等，呈现出微带果香的酒香，是构成酱香味的主体成分，可以由酵母酶催化生成，也可以通过有机酸和醇的酯化反应生成。豆类发酵食品中还含有亚油酸乙酯、十六酸乙酯、棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯等酯类成分，可使腊八豆的香气更丰富[20]。同时酯类还可以缓冲发酵豆制品中盐分的咸味。

2.2.6 烷烃类化合物

检测出的风味物质中，烷烃类的种类和含量都相对较高,包括C12～C28的烷烃以及一些支链烯烃等，其中有25种烷烃类在两种检测方法中均存在，另外SDE法检测出单独的10种，HS-SPME法检测出单独的6种，SDE法在提取过程中长时间的高温蒸馏可能得到较多的长链烃[21]。

蒎烯、莰烯、水芹烯、桧烯、萜品油烯、β-榄香烯、顺式-β-金合欢烯、(-)-α-荜澄茄油烯、α-姜黄烯、姜烯、(S)-β-红没药烯、β-倍半水芹烯等含量较高的烯烃在SDE法中几乎都检测到，其中α-姜黄烯在HS-SPME法中也都能检测到。α-蒎烯是无色透明液体，有松节油气味，是各种萜烯类合成香料的主要起始原料；α-姜黄烯存在于白肋烟叶中；水芹烯有黑胡椒、薄荷香气。烯烃化合物阈值较低，对腊八豆风味的贡献相对较大，也是一类主要的挥发性风味物质，而烷烃类化合物阈值较高，对腊八豆的风味贡献较小[22]，但可能有助于提高腊八豆的整体风味。它们主要来源于脂肪酸烷氧自由基的均裂，正构烷烃可能来自脂肪的自动氧化，支链烷烃可能来自支链脂肪酸的氧化[23]。检测出的烷类物质主要包括正十六烷、正十八烷、3-甲基十八烷、正二十烷、正二十一烷、正二十七烷等。正二十七烷主要存在于烤烟、白肋烟、香料烟烟叶和烟气中[24]。烷烃类物质一般是合成大分子物质的基础成分，也是合成某些香料的重要原料。

2.2.7 含硫、杂环类化合物

含硫化合物主要来源于含硫氨基酸的分解[25]。一般而言，含硫香料化合物是各类香料化合物中阈值最低的一类，在浓度很低时就可以产生令人愉快的食品香味，它们对食品的特征香味有很大的影响[26]。

杂环化合物是典型的呈香化合物，对发酵豆制品的风味影响也很大。杂环化合物来源于氨基酸和还原糖的Maillard反应，以及氨基酸的热分解等[27]。含量较高的有3,4-二甲基噻吩、含硫杂环化合物等。在发酵豆制品中含量虽然不高，但仍与微生物的生长代谢息息相关，也是腊八豆风味成分中不可或缺的物质。

3 结论

本研究采用SDE法和HS-SPME法与GC-MS联用分析4种腊八豆的挥发性风味成分，结果表明，两种不同的提取方式检测到的物质的种类与含量均不同，SDE法比HS-SPME法能较好地检测出醇类、醛类和酯类物质，且SDE法检出的物质相对峰面积均高于SPME法，但也有一部分物质只能被SDE法或HS-SPME法检测到，两种方法结合可以更好地检测出腊八豆中挥发性风味物质。

不同品牌的腊八豆因为原料、菌种、生产工艺的不同，其相关的风味指标也有差异，JC样品中醇类物质含量较高，LMZ样品中酯类物质含量较高，TYGS样品中含硫类和杂环类物质含量较高，TDJ样品中杂环类物质含量较高，但4种样品中烷烃类物质含量都很高。主要的挥发性风味物质在4种样品中几乎都能检测到。1-辛烯-3-醇、桉叶油醇、芳樟醇、2-茨醇、α-松油醇、糠醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、橙花醛、柠檬醛、甲基庚烯酮、烯丙基甲基二硫醚、乙基麦芽酚、丁香酚、棕榈酸乙酯、蒎烯、莰烯、桧烯、α-姜黄烯、正二十烷、正二十一烷等物质对腊八豆的风味有重要贡献作用，为进一步确定腊八豆风味成分的研究提供了基础。