正交法优化超声波辅助溶剂提取甜椒红色素工艺研究

王钊，张雪，黄淑媛，陈紫蕴，邹建

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046)

红色鲜艳、亮丽，是一种深受人们喜爱的色彩用在食品中能够增强食欲和刺激购买欲[1]。当前食品添加剂中存在大量的食用红色素，主要可分为人工合成红色素和天然红色素两大类。其中，合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、不易褪色、坚牢度大、性质稳定、易溶解、成本较低等优点[2]；但同时也存在营养价值较低，增加肝肾负担[3]，具有潜在的致癌、致畸、致突变作用等安全问题[4]。因此，天然可食用红色素的开发成为重要研究方向。

天然可食用红色素种类繁多，除着色外，还具有抗菌消炎、降低血脂等多重生理功能[5,6]。其中，辣椒红素因其美观的色泽、良好的上色能力、较高的安全性和潜在的营养保健功能受到人们的喜爱[7-9]；此外，辣椒红素还具有稳定性强，不易受光、热、酸、碱等条件影响的优点[10]。然而在提取辣椒红色素时需除辣，既增加了成本,又会产生新的杂质[11]。与之相比，红甜椒色泽艳丽，亩产量是辣椒的5倍[12]，其红色素的溶解性、稳定性、安全性与辣椒红色素相似，且无需除辣，工艺简单，极具研究和应用价值。研究表明，甜椒红色素色泽鲜艳，耐光、耐热、耐酸碱、耐氧化，色泽光亮，色度稳定，视感良好，并具有抗氧化，预防动脉粥样硬化，抑制肿瘤等多种保健功能，可用于食品、日化、医药等多个领域[13]。

鉴于甜椒红色素的优秀品质以及国内相关研究较少的现状[14]，本文拟通过有机溶剂提取法对甜椒红色素进行提取，并优化其工艺条件。在参考辣椒红素的相关提取工艺方案后[15,16]，引入超声波辅助提取手段，并通过正交试验法对各单因素提取条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

新鲜红甜椒：购于郑州市丹尼斯超市；无水乙醇(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)：天津富宇精细化工有限公司；丙酮(分析纯)、氯仿(分析纯)：北京国药集团化学试剂有限公司；无水甲醇(分析纯)、甲苯(分析纯)、石油醚(分析纯)：烟台双双化工有限公司；氢氧化钠(分析纯)：河北万晔科技发展有限公司；柠檬酸(分析纯)：潍坊英轩实业有限公司；抗坏血酸(分析纯)：郑州嵩桦商贸有限公司。

1.2 试验仪器

HY/HYS-3L/5L型油浴锅 郑州博科仪器设备有限公司；RE-32型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；KQ5200E型超声波清洗器 昆明市超声仪器有限公司；FA3204B型电子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；TU-1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；FreeZone型真空冷冻干燥仪 美国LABCONCO仪器公司。

1.3 试验步骤

1.3.1 红甜椒的预处理

由于甜椒含有多种营养成分和丰富的红色素，若直接暴露在空气中进行切片、粉碎等操作易发生氧化作用而影响甜椒品质。烘干等高温干燥处理方法，虽然具有良好的干燥效果，但在加热过程中可能对色素产生不利影响，因此本文采用真空冷冻干燥法[17,18]，根据真空冻干曲线对红甜椒进行冷冻干燥处理。最后将干燥好的甜椒粉碎，密封，置于干燥器中备用。

1.3.2 提取溶剂的选择

分别称取处理好的甜椒粉1.0 g，首先按照文献报道的最佳提取条件(料液比1∶16，温度50 ℃，时间3 h，溶剂乙醇)对溶剂进行筛选。分别量取等量的无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、无水甲醇、甲苯、石油醚7种有机溶剂按照文献条件进行提取，通过紫外可见分光光度计进行全波段扫描，观察紫外吸收曲线。已知甜椒红色素的乙醇溶液的最大吸收波长在450～480 nm，并确定其他溶剂最大吸收波长的位置。

1.3.3 单因素试验条件设计

分别设置料液比(1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28)、提取温度(50，55，60，65，70，75 ℃)、超声时间(10，20，30，40 min)、提取时间(3，3.5，4，4.5，5，5.5，6 h)4个单因素中的3个因素不变，探究另一个因素变化对提取甜椒红色素的影响，在此基础上进一步对单因素条件进行优化，直至达到最优水平。

1.3.4 正交试验设计

通过对单因素试验结果的分析，在此基础上，选择提取温度、料液比、超声时间、提取时间4个因素中的较优水平，选用L9(34)正交试验水平表，设计正交试验，进一步优化提取甜椒红色素的工艺条件。

1.3.5 最佳工艺验证试验

在正交试验得出的最佳提取条件下重复3次提取，对正交试验的结果进行验证，分析验证试验的结果。

2 结果与分析

2.1 溶剂对提取效果的影响

使用无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮等7种有机溶剂对甜椒红色素进行提取，通过紫外可见分光光度计检测其最大吸收波长和相应吸光度值。试验结果表明，不同溶剂显示的甜椒红色素最大吸收波长均在450～480 nm范围内，与文献报道吻合(见表1)；不同溶剂的提取效果差别较大，见图1。

表1 不同有机试剂显示的最大吸收波长Table 1 The maximum absorption wavelength of different organic reagents

图1 不同溶剂对提取效果的影响Fig.1 Effect of different solvents on the extraction effect

由图1可知，以上7种溶剂中氯仿对甜椒红色素的提取效果最好，然后由大到小依次是：甲醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醇>石油醚>甲苯，其中甲醇、丙酮和乙酸乙酯彼此间的差异较小，而石油醚和甲苯的提取效果明显较差，予以排除。由于氯仿、甲醇、丙酮均为有毒试剂，而乙酸乙酯沸点适中、毒性很小且提取效果明显优于乙醇，综合考虑安全性、溶剂价格和可操作性，选择乙酸乙酯作为提取试剂进一步优化试验条件。

2.2 单因素条件对提取效果的影响

2.2.1 料液比对提取效果的影响

(a)

(b)

称取5份1.0 g的甜椒粉，分别按照料液比1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28的比例准确量取乙酸乙酯，在50 ℃油浴中恒温提取3 h，过滤后定容至100 mL，在波长475 nm处平行测量3次，其平均吸光度值见图2中(a)。由图2中(a)可知，当料液比增大，提取效率随之增大，料液比1∶24时为最大值；此后继续增大料液比溶液的吸光度值有所下降(1∶28)。因此，以料液比1∶24为中心，对其两侧的料液比进行筛选，进行精确定位料液比的试验，试验结果见图2中(b)。当料液比从1∶21递增至1∶26时，测得的吸光度值依然以1∶24时最大，因此选择1∶24为最佳料液比条件。

2.2.2 超声时间对提取甜椒红色素的影响

称取4份1.0 g的甜椒粉，按照料液比1∶24加入乙酸乙酯，经超声处理(10，20，30，40 min)后，在50 ℃油浴条件下恒温提取3 h，过滤后定容至100 mL，在波长475 nm处平行测量3次，结果见图3中(a)。提取效率随超声时间增长而提高，当超声时间为30 min时，溶液的吸光度值最大，继续延长超声时间至40 min，吸光度值反而下降。然后以30 min时长为中心，考察其两侧时长条件下(25,35 min)的吸光度值，结果见图3中(b)。30 min时长条件下的吸光度值依然为最大值，表明30 min为最佳超声时间条件。

(a)

(b)

2.2.3 温度对提取甜椒红色素的影响

称取6份1.0 g的甜椒粉，分别按照1∶24的料液比和30 min的超声时间，在不同的油浴温度(50,55,60,65,70,75 ℃)下提取3 h，过滤后定容至100 mL，在波长475 nm处平行测量3次，得到平均吸光度，结果见图4中(a)。提取效率随提取温度的上升而上升，在50～75 ℃范围内，提取温度越高，提取效果越好，75 ℃时吸光度值最大。然后以75 ℃为中心对其两侧的温度筛选。又由于乙酸乙酯的沸点为77 ℃，因此选择73～77 ℃为温度范围，试验结果见图中4(b)。虽然吸光度值有所波动，但75 ℃时吸光度值依然最高，因此选择75 ℃为最佳提取温度。

(a)

(b)

2.2.4 提取时间对提取甜椒红色素的影响

称取6份1.0 g的甜椒粉，在已经确定的物料比(1∶24)、超声时间(30 min)、提取温度(75 ℃)条件下分别提取数小时，过滤后定容至100 mL，在波长475 nm处平行测量3次，平均吸光度值见图5。随提取时间的延长，吸光度值也随之增大，在4 h时具有最大值。当时间继续延长，吸光度值反而随之降低，虽然在5 h时略有增加，但总体趋势从4 h后下降，故选择4 h为最佳提取时间。

图5 不同提取时间对提取效果的影响Fig.5 Effect of different extraction time on the extraction effect

2.3 正交试验与条件优化

2.3.1 正交试验设计

通过对各单因素实验结果的分析，固定提取溶剂为乙酸乙酯不变，对提取温度(73，74，75 ℃)、料液比(1∶23、1∶24、1∶25)、提取时间(3.5，4，4.5 h)、超声时间(25，30，35 min)进行四因素三水平的正交试验，筛选最优提取方案，正交试验水平设计表见表2，试验结果见表3。

表2 L9(34)正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

续 表

由表3中的极差R值可知，提取甜椒红色素的4个影响因素均对提取效果有影响，各影响因素对提取效果的影响力大小依次为：A(提取温度)>B(料液比)>C(提取时间)>D(超声时间)，其中最重要的影响因素是提取温度。因此，根据正交试验结果，提取甜椒红色素的最优方案为A2B2C1D2，即提取温度75 ℃、料液比1∶24、提取时间3.5 h，超声时间30 min。

2.3.2 最优工艺条件验证试验

表4 重复试验结果Table 4 Results of repeated experiment

由于最佳提取方案并未在正交试验表中，为确保其真实性，在该提取工艺条件下进行了3 组重复验证性试验，并取其平均值。由表4可知，验证试验结果具有代表性，表明该提取工艺条件是合理可行的，重现性好。

3 结论

通过对甜椒粉中甜椒红色素提取的单因素条件进行筛选，结果表明在单因素试验中，以乙酸乙酯为提取剂，各项最佳条件分别为：温度75 ℃，料液比1∶24，超声时间30 min，提取时间4 h。而在正交试验设计中，最佳提取工艺条件为：以乙酸乙酯为提取试剂，温度75 ℃、料液比1∶24、提取时间3.5 h、超声时间30 min。通过3次平行重复验证试验，所得吸光度值重现性较好，说明此工艺条件对甜椒红色素的提取具有明显优势，为将来更深入地研究甜椒红色素的工业化生产提供了一定的理论支持。