半番鸭谷胱甘肽过氧化物酶的组织表达与酶活力研究

章琳俐,李 丽,辛清武,朱志明,缪中纬,郑嫩珠

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所,福建 福州 350013)

抗氧化系统是动物机体重要的保护系统,防止细胞免受自由基和活性氧等的攻击。抗氧化系统失衡可引起组织的自由基累积,造成脂质过氧化、细胞膜和DNA损伤等一系列氧化损伤[1]。在畜禽生产上抗氧化系统失衡可导致动物对运输或运动过程的应激易感,使宰后组织氧化损伤、肉质下降,甚至病理损伤[2-5]。了解家禽组织的抗氧化特性及相关基因表达的分子机制,对于探索减少生产中各种应激的不良影响的方法具有重要意义。

抗氧化酶是抗氧化系统的重要组成成员,是清除自由基和活性氧的第一道防线。其中,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px/GPx)是重要的抗氧化酶之一,GSH-Px可通过催化还原作用清除自由基代偿产物过氧化氢及脂质过氧化产物,防止其对组织的损伤[6]。有关研究结果显示不同物种和组织间GSH-Px的活性和基因表达水平不同[7,8]。目前关于GSH-Px基因表达和酶活性在多个物种中已有研究报道,但在鸭上的研究报道较少[7-9]。了解抗氧化酶的组织分布特性,对于探索预防家鸭生产中各种应激的不良影响的方法具有重要意义。

半番鸭是继北京鸭、番鸭后极具发展潜力的肉用仔鸭,具有瘦肉率高、脂肪少、耐粗饲、抗病力强等特点,也是生产肥肝和羽毛的重要来源,成为水禽肉用品种改良研究的热点之一[10]。目前,关于半番鸭抗氧化特性的研究报道较少,少数报道也仅针对血液或单一组织[11,12]。了解半番鸭不同组织的抗氧化水平可为半番鸭对环境因子(如应激)响应能力的研究提供理论参考,在科研和生产上都具有一定的生物学意义。因此,本研究通过测定半番鸭不同组织GSH-Px基因表达水平和酶活力,探索了半番鸭不同组织的抗氧化特性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鸭来源于福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物养殖试验基地,按常规操作程序进行饲养管理,饲料由福建华龙集团饲料有限公司提供,自由采食和饮水,在不同生长时期的饲料营养水平见表1。在70日龄时随机选取5只同批次健康的半番鸭,颈动脉放血处死后,采集其组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌胃和胸肌)样品,立即投入液氮中,于-80 ℃保存备用。

表1 试验鸭饲料的营养水平

1.2 GSH-Px基因表达的qRT-PCR检测和分析

各组织经匀浆提取总RNA (Trizol法),检测RNA含量、纯度;调整总RNA浓度至1 μg/μL,后转录成cDNA (Super ScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Super反转试剂盒, Invitrogen,美国),于-80 ℃保存备用。

引物根据Gen Bank已公布的鸭GSH-Px和β-actin基因序列应用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件进行设计,由生工生物工程上海股份有限公司合成,引物序列见表2。以β-actin基因为内参,采用CFX384多重实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国)检测半番鸭各组织的GSH-Px mRNA表达情况,每个样品重复检测5次。反应体系(20 μL)见表3,反应条件:95 ℃ 1 min;40个循环(95 ℃ 15 s,63 ℃ 25 s,收集荧光)；从55 ℃至95 ℃，进行溶解曲线分析。采用2-ΔΔCt值方法来计算mRNA的相对表达量。

表2 荧光定量PCR引物的信息

表3 定量PCR反应体系

1.3 抗氧化酶活力测定

提取蛋白,用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定浓度后,用组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒测定GSH-Px的活力,操作步骤按照试剂说明书进行。所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。GSH-Px活力测定采用化学比色法,1个酶活力单位(U/mg)表示在扣除非酶促反应引起的还原型谷胱甘肽(GSH)减少的部分后每分钟每毫克组织蛋白反应体系中GSH浓度减少1 μmol/L。

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0软件对不同组织mRNA相对表达量和抗氧化酶活力进行描述性数据统计、多重比较、显著性检验及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 半番鸭GSH-Px基因的qRT-PCR检测

半番鸭各组织GSH-Px和β-actin基因的qRT-PCR检测结果见图1。如图1所示，目的基因和β-actin的扩增曲线均呈“S”形,基线平缓,溶解曲线单峰,表明基因的动力学曲线整体平行性较好,扩增产物单一,未见引物二聚体和非特异性扩增产物。

上图为GSH-Px基因；下图为β-actin基因。图1 qRT-PCR扩增曲线和溶解曲线

2.2 GSH-Px mRNA的组织表达特点

qRT-PCR结果显示,GSH-Px mRNA在半番鸭各组织(肌胃、心脏、肝脏、脾脏、肝脏、肺脏、胸肌和肾脏)中均有表达,但组织间表达差异显著(图2)。其中肾脏GSH-Px mRNA的表达量最高,胸肌次之,肌胃表达量最低,肾脏表达量是肌胃的45倍。GSH-Px mRNA相对表达水平的总体情况为:肾脏>胸肌>肺脏>脾脏>肝脏>心脏>肌胃。

1:肌胃;2:心脏;3:肝脏;4:脾脏;5:肺脏;6:胸肌;7:肾脏。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。内参基因为β-actin;n=5。

图2 半番鸭组织GSH-Px mRNA的相对表达水平

2.3 半番鸭组织的GSH-Px活力检测结果

选取了基因表达水平具有代表性的肝脏、胸肌、肾脏和肌胃,检测各组织的GSH-Px活力，结果如表4所示。结果显示：胸肌和肝脏的GSH-Px活力显著高于肾脏和肌胃的(P<0.01);肌胃的酶活力最低；各组织GSH-Px活力的总体情况为胸肌>肝脏>肾脏>肌胃。

表4 半番鸭不同组织的GSH-Px活力 U/mg

注:同列数据后附不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.4 GSH-Px mRNA表达水平与酶活力的相关性

利用SPSS 17.0软件对组织GSH-Px活力与mRNA表达水平间的相关性进行分析,结果(表5)显示,除胸肌两者的相关性达到显著水平(P<0.05)外,在其余组织中均未存在显著相关关系。但从总体上来看,胸肌、肝脏和肾脏的两个指标均高于肌胃,胸肌的GSH-Px活力与mRNA表达水平都较高,肌胃两者都较低。

表5 各组织GSH-Px活力与mRNA表达水平间的相关系数

注:“*”表示相关性达显著(P<0.05)水平。

3 讨论

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是动物机体中重要的抗氧化酶,不仅在维持细胞氧化还原状态的平衡中发挥重要作用,并可影响细胞代谢和应激抵抗能力[13]。GSH-Px也可对一些重要的生理活动产生影响,如分化、信号转导、前炎性因子和类花生酸类物质的产生[14]。在禽类大多数组织器官中均发现有GSH-Px的存在。Surai[15]报道了鸡胚胎时期不同组织GSH-Px活性的变化和新生雏鸡不同组织间酶活性的特征。Tan等[16]的研究结果显示鸡肝脏GSH-Px的活力与热应激有关。

本研究中半番鸭GSH-Px mRNA广泛表达于不同组织器官,但组织间表达差异明显，总体趋势为肾脏>胸肌>肺脏>脾脏>肝脏>心脏>肌胃。与火鸡上的报道类似,半番鸭肾脏GSH-Px mRNA的表达水平最高;但与之不同的是半番鸭胸肌组织也具有较高的GSH-Px mRNA表达水平,而火鸡胸肌的GSH-Px mRNA表达水平最低[17]。Xu等[18]对猪的研究结果显示GSH-Px mRNA表达水平表现为肌肉>肾脏>肝脏,而猩猩GSH-Px mRNA在肝脏、肾脏中表达较高。不同物种组织间GSH-Px mRNA表达显示出较大的差异和不同的组织分布规律,说明抗氧化酶基因表达具有物种和组织特性。

半番鸭胸肌和肝脏的GSH-Px活力较高,肾脏次之,肌胃最低。Sunde等[17]报道的火鸡各组织器官GSH-Px活力为肾脏>肌胃>肝脏>胸肌。Toshiro等[19]的报道显示35日龄鸡的GSH-Px活力在肝脏中最高,在肾脏中次之,在胸肌中最低。与鸡和火鸡胸肌低GSH-Px活力不同,半番鸭胸肌显示出较高的GSH-Px活力。Daun等[9]对鸡、火鸡、鸭、鸵鸟和羊肌肉的GSH-Px活力进行比较后,也发现鸭肌肉的GSH-Px活力显著高于其它动物。半番鸭胸肌较高的GSH-Px活力提示其胸肌组织相对于其它组织或其它物种肌肉组织可能具有更高的抗氧化能力，这可能与鸭鹅等水禽胸肌发达有关,半番鸭的胸肌率可达16%以上[14],而鸡的胸肌率在9.5%左右[16]。一些研究表明骨骼肌收缩产生的活性氧不仅可使骨骼肌氧化应激水平升高,同时也能提高其自身的抗氧化防御水平[20]。鸭的肌肉组织或许是研究肌肉抗氧化和肉品质调控的模型。

本研究中半番鸭组织GSH-Px活力与mRNA表达水平的变化不完全一致,可能是由于抗氧化酶基因表达受转录后调控影响[21],另一方面抗氧化酶活力也会受底物水平等因素的影响,因此抗氧化酶mRNA表达水平与其活力不总是呈现简单的相关性[22,23]。但从总体上来看,半番鸭代谢相对活跃的组织(肝脏、肾脏和胸肌)酶活力和mRNA表达水平均较高,而肌胃的两个指标均较低,这可能与酶生理功能及组织代谢水平有关。肝脏是动物物质、能量代谢的重要器官,肾脏是禽类重要排泄器官,胸肌则是水禽重要的运动器官,都具有较高的代谢水平,需要维持较强的抗氧化能力和水平。

4 结论

半番鸭GSH-Px基因表达和酶活力具有组织特异性。不同组织的GSH-Px活力差异可能与酶自身的生理功能以及组织代谢水平有关。半番鸭胸肌较高的GSH-Px酶活力和mRNA表达水平提示半番鸭胸肌具有较高的抗氧化能力。