一株强化发酵甜瓣子的乳酸片球菌特性及应用效果评价

邓维琴，李雄波，张其圣,2，陈功,2，范智义，胡廷，李恒,2,3*

1(四川省食品发酵工业研究设计院，四川 成都， 611130)2(四川东坡中国泡菜产业技术研究院，四川 眉山， 620030)3(成都市丹丹川菜调味品产业研究院有限公司，四川 成都， 611730)4(成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都， 610106)

郫县豆瓣是以红辣椒、蚕豆为主要原料，食用盐、小麦粉等为辅料酿制而成的传统调味品。其生产工艺主要包括制曲、甜瓣子发酵、辣椒醅发酵及后发酵生香等阶段[1]。原料中丰富的营养成分在甜瓣子发酵过程中形成各种风味物质，对成品品质有突出贡献，甜瓣子发酵是郫县豆瓣风味形成的关键阶段。甜瓣子发酵过程中米曲霉、芽孢杆菌、乳酸菌以及酵母菌是主要发酵菌株，乳酸菌对豆瓣酱风味的呈现有着重要作用[2-6]。

乳酸菌是发酵食品中常用的益生菌，其发酵过程中可产生有机酸[7]、芳香化合物[8]、酶[9]以及胞外多糖[10]等多种物质，并为发酵体系提供有机酸、双乙酰、过氧化氢及细菌素等多种活性物质，有效增强感官品质、抑制不良微生物、延长产品保质期[11-13]。目前，传统发酵酱中乳酸菌的筛选和应用已成为领域的研究热点。CUI等[14]从黄豆酱中筛选了28种嗜盐乳酸菌，利用筛选的嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)结合酵母菌对黄豆酱进行强化发酵，可增加产品中挥发性风味物质含量；陈伯林[15]研究发现在酱油发酵第6天添加0.25%的乳酸菌进行发酵，可显著改善酱油的风味，提高酱油中乳酸含量；WANG等[16]发现在酱醅发酵第15天接种乳酸菌，酱醅发酵第45天接种酵母菌，可提高酱油中挥发性风味物质的含量；IWASAKI等[17]研究了氧化铝陶瓷固定化乳酸菌在酱油发酵中的应用，固定化的嗜盐片球菌(Pediococcushalophilus)可使酱醅压榨液中的乳酸含量达到7～9 g/L。

乳酸菌在豆瓣酱-甜瓣子发酵中的应用也逐渐受到学者的关注。VEMI等[18]研究发现乳酸菌添加到蚕豆酱中可提高肽酶、β-葡糖苷酶、胞外多糖、抑菌物质等代谢产物的含量，明显提高蚕豆酱品质。李从虎等[19]在甜瓣子发酵阶段接种耐盐乳酸菌沪酿1.08和酵母菌，甜瓣子中主要呈香物质及高级脂肪酸的含量得到显著提升。乳酸菌强化可加快营养物质代谢，促进发酵，改善甜瓣子风味。然而，目前还没有一种强化甜瓣子发酵的专用乳酸菌及菌剂。本研究从传统发酵甜瓣子中筛选优势耐盐乳酸菌，研究其生长特性，并制备乳酸菌剂，研究乳酸菌剂强化发酵甜瓣子的效果，以期提供一种甜瓣子发酵专用的乳酸菌剂，为其在甜瓣子发酵体系的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株筛选原料

传统发酵甜瓣子，四川省丹丹郫县豆瓣公司。

1.1.2 试剂及培养物

TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒、无水乙醇、氢氧化钠溶液、甲醛溶液、乳酸菌选择性培养基(改良MRS培养基)，上海艾研生物科技有限公司；27F引物、1492R引物、MIX酶、超纯水、250 bp Maker、琼脂糖，上海慧颖生物科技有限公司；0.05 mol/L HCL溶液。

1.2 仪器与设备

LGJ-500型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；SWDB204SD-01型分离机，北京中船绿洲机器有限公司；752G紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器股份有限公司；DYY-6D电泳仪，北京六一生物科技有限公司；BCD-201MLT冰箱，合肥美菱股份有限公司；PV1189-型发酵罐，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司；H2050R-1离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；PHSJ-4型pH计，上海仪电分析仪器股份有限公司；T960A智能梯度PCR仪，杭州晶格科学仪器有限公司；高效液相色谱仪，Agilent 1260；443D，氨基酸分析仪，德国Sykam。

1.3 试验方法

1.3.1 产酸能力强的乳酸菌分离鉴定

1.3.1.1 菌株分离

称取10 g甜瓣子至盛装有90 mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，混匀、逐次稀释，采用MRS固体培养基(加入2% CaCO3)倾注，每个梯度3个平行，37 ℃培养24 h。挑取疑似乳酸菌形态的单菌落纯化，逐步传代划线分离纯化至菌株在MRS培养基上大小形态一致。根据MRS CaCO3平板中透明圈的大小初步筛选得到4株典型产酸能力强的乳酸菌，分别编号为ND1、ND2、ND3、ND5，于MRS培养基斜面划线，37 ℃培育24 h，4 ℃保藏。

1.3.1.2 菌株生长曲线测定

分别挑取ND1、ND2、ND3、ND5单菌落接种于100 mL MRS液体培养基中，培养12 h，得到种子液。分别吸取1 mL ND1、ND2、ND3、ND5的种子液至100 mL无菌MRS肉汤培养基中，菌株接种浓度为107CFU/mL，每组3个平行。定时取样，测定发酵液在610 nm条件吸光值。

1.3.1.3 产酸能力测定

分别吸取1 mL ND1、ND2、ND3、ND5的种子液至100 mL无菌MRS肉汤培养基中，菌株接种浓度为107CFU/mL，37 ℃培养24 h。参照GB/T 12456—2008方法，采用标定后的NaOH 溶液(约0.049 mol/L)进行滴定，计算发酵液总酸含量，同时记录发酵终点pH值，每组3个平行。

1.3.1.4 优势菌株形态及16S rRNA测序

采用MRS培养基平板划线分离纯化后，进行革兰氏染色显微镜观察形态，记录菌落形态，结合《伯杰氏细菌鉴定手册(第8版)》进行初步鉴定。

挑取优势菌株单菌落接入100 mL MRS肉汤培养液中，37 ℃培养24 h后，采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取细菌DNA。PCR扩增16S rRNA片段，PCR扩增反应的体系为：1 μL 27 F引物，1 μL 1 492 R引物，3 μL DNA模板，MIX酶12.5 μL，超纯水12.5 μL，共30 μL。扩增程序为：预变性94 ℃、4 min，变性94 ℃、1 min，退火60 ℃、45 s，延伸72 ℃、90 s，末端延伸72 ℃、10 min，变性、退火、延伸30次循环。将扩增物送北京擎科生物有限公司测序，得到的序列通过BLAST比对，采用Mega 5.0建立系统发育树进行分子生物学鉴定。

1.3.2 菌株ND1的生长特性

1.3.2.1 不同盐度条件生长情况

根据测定结果筛选出产酸能力和生长能力最强的菌株ND1进行深入研究。挑取菌株ND1的单菌落接入100 mL MRS培养液中，培养12 h后作为种子液。吸取1 mL种子液加入100 mL不同NaCl浓度的MRS培养液中，培养液中NaCl质量分数分别为3%、5%、8%、10%。接种浓度约为107CFU/mL，37 ℃培养，每组3个平行，定时取样测定OD610。

1.3.2.2 不同酸性条件生长情况

吸取1 mL菌株ND1种子液于100 mL不同pH值的MRS培养液中，培养液中接种浓度约为107CFU/mL，培养液初始pH值分别为3.5、4、4.5、5、6，每组3个平行，37 ℃培养，定时取样测定OD610。

1.3.2.3 不同温度条件生长情况

吸取1 mL ND1种子液于100 mL MRS培养液中，培养液中接种浓度约为107CFU/mL，分别在4、10、20、30、37、45、50 ℃ 条件培养，每组3个平行，定时取样测定培养液OD610。

1.3.3 乳酸菌剂制备

挑取ND1单菌落接种至30 mL MRS液体培养基中活化，37 ℃培养18 h；将活化液转移至3 L MRS液体培养基中，37 ℃培养18 h得到种子液。采用500 L发酵罐扩大培养，调整MRS液体培养基pH至 6.0，接入3 L种子液，37 ℃培养18 h，发酵液稀释10倍后OD610达到1.8左右。发酵原液低温离心得到菌体，按1∶1(g∶mL)加入20%海藻糖保护剂后，采用冷冻干燥机干燥48 h得到菌剂。

1.3.4 产香乳酸菌剂中活菌计数

准确称取1.3.3制得的乳酸菌菌剂1 g，与99 mL无菌水(加入适量玻璃珠)充分混匀后，得到10-2g/mL稀释液。逐次稀释，选择适宜浓度的稀释液进行倾注，混匀，37 ℃培养24 h，计数培养皿中的菌落数，并由此计算菌粉中的活菌数。

1.3.5 乳酸菌剂强化发酵甜瓣子

将霉豆瓣与盐水按1∶1比例混合，加入质量分数15%的盐和适量乳酸菌剂，乳酸菌接种量为107CFU/g，搅拌混匀，37 ℃发酵60 d。以不添加乳酸菌剂的甜瓣子发酵组为空白组，试验组和空白组分别设置3个平行。

1.3.6 强化发酵甜瓣子品质分析

总酸、氨基酸态氮含量参考GB 5009.235—2016测定；甜瓣子中氨基酸的测定参考GB5009.124—2016进行测定；甜瓣子中有机酸含量参考GB5009.157—2016测定。

2 结果与分析

2.1 高效乳酸菌的筛选

初筛得到的4株乳酸菌生长曲线如图1所示。菌株ND1在24 h内生长最为迅速，生长量高于其他菌株，而菌株ND3生长速度最缓慢。

图1 菌株ND1、ND2、ND3、ND5在24 h内生长曲线Fig.1 Growth curve of the four strains in 24 h

将菌株ND1、ND2、ND3、ND5接种于MRS液体培养基中，37 ℃发酵24 h后测定乳酸含量，测定结果如图2所示。培养24 h后，菌株ND1发酵液中乳酸含量为1.296 g/100g，ND2发酵液乳酸含量为1.263 g/100g，菌株ND3发酵液乳酸含量为0.977 g/100g，菌株ND5发酵液乳酸含量为1.211 g/100g。菌株ND1产乳酸能力高于其他菌株。根据以上结果筛选得到产酸能力最强，生长繁殖能力最强的菌株ND1为后续研究菌株。

图2 菌株ND1、ND2、ND3、ND5产总酸量Fig.2 The concentration of total acid in the fermentationbroth of the four strains注：图中不同字母代表差异显著(P<0.05)

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌落形态

将菌株ND1在MRS固体培养基平板上划线培养，37 ℃培育24 h，观察其在MRS培养基上的形态特征，革兰氏染色后观察细胞形态。图3为其菌落形态及显微形态。菌落呈圆形，乳白色，隆起，边缘整齐，表面光滑，有光泽，菌落较小。革兰氏染色呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌，显微镜下形态为小球形，对生，四联，无芽孢。

图3 菌落形态及显微形态照片Fig.3 Colonial and cellular morphology of strain ND1

2.2.2 分子生物学鉴定

进化树结果(图4)显示菌株ND1与乳酸片球菌标准菌株PediococcusacidilacticiDSM 20284(AJ305320.1)聚为一个分支，相似度高，再结合形态特征，初步鉴定ND1为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

图4 菌株ND1系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain ND1

2.3 优势菌株ND1的生长特性

2.3.1 优势菌株ND1不同酸性条件下的生长情况

图5为ND1在不同酸性条件的生长情况，菌株ND1在培养基初始pH为5和6条件下生长速度最快，迅速进入对数生长期，10 h后进入稳定期，此后OD值基本维持稳定。初始培养基酸度越大，ND1生长速率越缓慢，在初始pH 3.5～4.5条件下均能良好生长。初始pH值为3.5时，ND1生长极为缓慢，培养8 h后开始缓慢生长，培养24 h 后OD610为0.448。

图5 菌株ND1不同pH条件下的生长曲线Fig.5 Growth curve of strain ND1 in MRS medium with different pH

2.3.2 优势菌株ND1不同盐度条件下的生长情况

甜瓣子发酵盐度一般为10%～14%(质量分数)，因此菌株耐盐能力对其后期的应用极其重要。本试验筛选的菌株ND1在NaCl浓度为3%、5%、8%条件下均能生长。盐度越高，菌株生长速度越缓慢，NaCl为10%的条件生长极为缓慢，生长情况如图6所示。菌株ND1能耐受10%的NaCl，在NaCl浓度为8%的条件下能缓慢生长，在3%和5%条件下长势与对照组相同，生长量低于对照组。

图6 菌株ND1不同盐度下的生长曲线Fig.6 Growth curve of strain ND1 in MRS medium with different concentration of NaCl

2.3.3 优势菌株ND1不同温度条件下的生长曲线

温度是影响菌株生长和发酵甜瓣子的重要因素，目前豆瓣酱发酵多属于常温发酵(发酵池温度从冬天到夏天温度变化大，在8～40 ℃)，冬天发酵温度低导致甜瓣子发酵速度极其缓慢。因此菌株能否在广谱温度条件下生长对菌株在豆瓣酱中的应用具有重要意义。图7是菌株ND1在高温条件的生长情况，菌株ND1在30、37、45、50 ℃下均能生长，45 ℃条件下生长速度最快。菌株ND1在37 ℃和45 ℃长势相同，2 h开始进入对数期，在10 h后进入稳定期，稳定期生长量最大，OD610约为1.732。图8为菌株ND1在低温条件的生长情况，菌株在试验组低温条件下均能生长，但生长速度缓慢。菌株ND1在10 ℃和20 ℃培养条件下生长趋势相同，在9 h开始进入对数期，在48 h后增长速度变缓，146 h开始进入稳定期。菌株ND1在4 ℃培养条件下，迟滞期较长，能缓慢生长。综上，乳酸片球菌ND1在4～50 ℃条件均能生长，能在广谱温度范围内生长。高温条件更利于菌株ND1的生长，其在37～45 ℃生长速度最快，生长量最大。菌株ND1在低温(4～20 ℃)条件也能生长，这为菌株在低温发酵食品的使用提供了可能性。

图7 ND1在高温条件生长曲线Fig.7 Growth curve of strain ND1 in MRS medium at different temperature(high temperature)

图8 ND1在低温条件生长曲线Fig.8 Growth curve of strain ND1 in MRS medium at different temperature(low temperature)

2.4 乳酸菌剂制备效果

采用500 L发酵罐扩大培养18 h，发酵液稀释10倍后OD610达到1.8左右。发酵原液低温离心得到菌泥，1∶1(g ∶mL)加入10%(质量分数)海藻糖保护剂后，采用冷冻干燥机干燥48 h，得到约1.5 kg菌粉，菌粉呈白色粉末状，乳酸菌活菌数为1.07×1012CFU/g。发酵菌剂得率高，活菌浓度大，利于推广应用。

2.5 乳酸菌剂强化发酵甜瓣子品质评价

2.5.1 氨基态氮和总酸含量分析

添加ND1乳酸菌剂发酵60 d的甜瓣子氨基态氮含量为0.804 g/100 g，总酸含量为2.849 g/100g；对照组氨基态氮含量为0.807 g/100g，总酸含量为2.023 g/100g。ND1乳酸菌剂对氨基态氮含量的影响较小，而对总酸含量的生成有促进作用，添加ND1菌剂的甜瓣子总酸含量略高于对照组。

2.5.2 氨基酸含量分析

由表1可知，添加ND1乳酸菌剂发酵的甜瓣子中氨基酸的组成与对照组相似，氨基酸总量(相对百分含量)分别为13.25%和13.12%。谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸为主要氨基酸。乳酸菌剂强化不影响甜瓣子发酵体系氨基酸的组成。

表1 乳酸菌剂ND1发酵甜瓣子中氨基酸含量统计 单位：%

注：t检验P<0.05表示样品间差异显著，不同字母代表差异显著(下同)

2.5.3 有机酸含量分析

由表2可知，乳酸菌剂ND1促进有机酸的形成，ND1强化发酵组有机酸总量为27.08 mg/g，而空白组有机酸总量为19.63 mg/g。甜瓣子中乙酸、乳酸、苹果酸、丁二酸、柠檬酸为主要的有机酸，以乙酸含量最为突出，分别为15.00和9.50 mg/g。乳酸菌剂ND1强化发酵甜瓣子对乙酸、乳酸、苹果酸的增强作用最明显，其中乳酸含量由空白组的1.86 mg/g增加到2.17 mg/g，苹果酸由空白组的2.15 mg/g增加到3.71 mg/g，乙酸含量由空白组的9.50 g/mg增加到15.00 mg/g。

表2 乳酸菌剂ND1发酵甜瓣子中有机酸含量统计 单位：mg/g

3 讨论

乳酸菌是发酵酱中重要的有益微生物。目前，乳酸菌尤其是四联球菌被广泛应用于发酵酱的增香，可明显提高酱中有机酸、乙酸、甲酸、糠醛、糠醇等风味物质的含量[20]。WU 等[21]采用四联球菌强化发酵豆瓣酱，豆瓣酱中氨基态氮、酸类、醇类等挥发性成分均有所提高，而亚硝酸盐含量减少了39.4%。关统伟等[24]研究表明乳酸片球菌在甜瓣子发酵过程中相对含量较高，是甜瓣子发酵过程中优势细菌。乳酸片球菌一般能耐受9%～10%的盐，耐盐能力较强[25]。乳酸片球菌可通过代谢葡萄糖、果糖、甘露糖等物质产有机酸，增强风味，还能产生胞外多糖[26]。乳酸片球菌能合成片球菌素，被广泛的用作天然抑菌剂[27-28]。乳酸片球菌的环境适应能力更强，生长速度更快，因此采用乳酸片球菌用于甜瓣子强化发酵具有明显优势。

本研究筛选得到的乳酸片球菌ND1具有良好的温度、酸度、盐度适应性，其生长能力及环境耐受能力明显高于目前已报道的发酵酱中筛选出的乳酸菌[29]。菌株ND1在低温条件(4～10 ℃)也能缓慢生长，这为菌株在低温发酵食品的使用提供了可能性[30]。乳酸片球菌ND1在发酵罐中易培养，发酵得到的乳酸菌菌剂活菌数可达1.07×1012CFU/g。产品得率较高，利于其在甜瓣子发酵企业的推广应用。将乳酸片球菌ND1菌剂添加于甜瓣子发酵阶段，甜瓣子的有机酸含量得到明显提高，尤其是乙酸、苹果酸、乳酸的含量得到明显提升。因此，甜瓣子中乳酸片球菌ND1菌剂的添加可达到调控产品有机酸组成及风味的目的。

4 结论

从传统发酵甜瓣子中筛选得到1株产酸能力强、生长迅速的乳酸片球菌ND1。乳酸片球菌ND1具有良好的温度、盐度、酸度适应性，其生长能力及环境耐受能力明显高于已报道的发酵酱中筛选出的乳酸菌。菌株繁殖能力强，扩大培养制备菌剂活菌得率高，为其推广应用提供了优势。利用乳酸片球菌ND1菌剂强化发酵甜瓣子，可有效提高有机酸尤其是乙酸、苹果酸、乳酸的含量。采用乳酸片球菌强化发酵甜瓣子具有明显优势，菌剂制备高活菌数的方法为其工业推广应用提供了保障。