结肠癌组织中自噬相关蛋白p62、Beclin1的表达与其临床病理特征的相关性

李海平 卢家吉

自噬是细胞降解被损害细胞器及蛋白质的过程，其在肿瘤发生、发展中可能发挥着双重作用，在肿瘤的发生、发展中具有重要的角色[1-3]。但细胞自噬过程受一系列基因的严格调控，其中自噬分子Beclin-1是肿瘤细胞凋亡、分化及肿瘤细胞自噬间的桥梁，也是参与调控自噬体形成的关键因子，在肿瘤的发生、发展中必不可少[4-5]；自噬分子p62可使靶蛋白泛素化，并随着降解产物包裹人自噬泡而被降解，是自噬的重要标志，即p62可通过自噬被降解，其表达增强则自噬受抑[6-7]。目前有关自噬分子p62、Beclin1在结肠癌方面的研究尚不多见，因此本研究旨在探究结肠癌组织中p62、Beclin1蛋白表达情况，分析其与结肠癌患者临床病理特征的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2016年9月至2018年3月于本院住院治疗的73例结肠癌患者为研究对象，搜集其临床资料并进行回顾性分析。所有患者均经病理学诊断确诊并行结肠癌根治术治疗，临床资料完整，预计生存期1年以上，手术情况及随访记录清晰，术前未接受过任何抗肿瘤治疗。73例患者中男性40例，女性33例；年龄33～82岁，平均(56.42±5.03)岁。采集所有患者结肠癌病理组织标本73例，另随机选取35例患者并采集距肿瘤组织至少6 cm处的正常癌旁结肠组织。

1.2 主要试剂及仪器

鼠抗人p62、Beclin1多克隆抗体(英国Abcam公司)，免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)等；CUT4062型石蜡切片机(德国SLEE公司)，YD-A型生物组织摊片机(德国Lecia公司)，CKX41-A32RC型倒置显微镜(日本Olympus公司)等。

1.3 实验方法

常规制备石蜡组织切片，厚度约4 μm，经脱蜡，水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶处理后，以山羊血清封闭2 h，常温下复温，滴加鼠抗人p62、Beclin1多克隆抗体(浓度1∶100)，37 ℃下孵育30 min，经PBS洗涤；滴加广谱通用型非生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min，经PBS洗涤；滴加DAB染色液，显微镜下控制显色反应时间；然后经苏木精复染2 min，梯度酒精脱水，自然晾干后，以中性树胶封片，于光学显微镜下观察各组织标本中p62、Beclin1蛋白表达情况。

1.4 染色结果判定标准

p62、Beclin1蛋白阳性着色均以细胞核或细胞质中出现棕黄色或棕褐色为准，以半定量积分法判定染色结果：随机选取5个视野，于高倍镜下对各个视野中的阳性细胞数进行评分，未见阳性细胞为阴性计0分；阳性细胞百分比≤10%计1分；阳性细胞百分比>10%～50%计2分；阳性细胞百分比>50%～75%计3分；阳性细胞百分比>75%计4分。另据染色强度进行评分：未见着色计0分；浅黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。染色总评分=阳性细胞数评分×阳性染色强度评分。若染色总评分为0～4分，则为阴性；若染色总评分≥4分，则为阳性[8]。

1.5 观察指标

(1)观察各组标本组织中p62、Beclin1蛋白表达情况，统计并比较各组织标本中p62、Beclin1蛋白阳性表达率；(2)统计并比较p62、Beclin1蛋白阳性表达患者相关临床病理特征，分析其与p62、Beclin1蛋白表达的关系。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，p62、Beclin1蛋白阳性表达率均以百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验；双向有序等级资料采用Spearman秩相关检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织及癌旁正常组织p62、Beclin1蛋白表达情况比较

免疫组化染色显示，阳性着色呈现棕黄色或棕褐色，且Beclin1蛋白阳性表达主要分布于细胞质，p62蛋白阳性表达主要分布于细胞核及细胞质。

结肠癌组织及癌旁正常组织p62蛋白阳性表达率分别为12.33%、28.57%，Beclin1蛋白阳性表达率分别为72.60%、31.43%。结肠癌组织p62蛋白阳性表达率显著低于癌旁正常组织(P<0.05)，Beclin1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常组织(P<0.01)。见表1。

表1 结肠癌组织及癌旁正常组织中p62、Beclin1蛋白阳性表达率比较(例，%)

2.2 结肠癌组织中p62、Beclin1蛋白表达相关性分析

Spearman秩相关检验结果显示，结肠癌组织中p62蛋白及Beclin1蛋白阳性表达呈显著负相关(γ=-0.473，P=0.002)。见表2。

2.3 结肠癌组织中p62、Beclin1蛋白表达与临床病理特征的关系

TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期患者Beclin1蛋白阳性率高于Ⅲ期患者；淋巴结转移患者Beclin1蛋白阳性率高于无淋巴结转移患者(P<0.05)；而不同临床病理特征结肠癌患者病理组织中p62蛋白阳性表达率均无显著性差异(P>0.05)。见表3。

表2 结肠癌组织中p62、Beclin1蛋白表达相关性分析(例，%)

表3 结肠癌组织中p62、Beclin1蛋白表达与临床病理特征的关系(例，%)

3 讨论

肿瘤细胞多伴有自噬活性异常，在肿瘤发生早期，细胞自噬功能缺失可导致细胞恶性转化，促进肿瘤发生与生长；而在肿瘤晚期，随着肿瘤体积的不断增大，细胞处于缺氧及营养匮乏状态，自噬激活作为一种生存机制维持肿瘤细胞在不利环境中存活，促进肿瘤生长，表现出时间上的双重性[9-10]。因此细胞自噬与肿瘤的发生密切相关，推测结肠癌细胞自噬能力变化对其进展也具有重要意义，本研究旨在深入探究自噬相关分子Beclin-1、p62蛋白在结肠癌组织中的表达情况，并分析其与结肠癌患者临床病理特征间的相关性。

Beclin1是首个被鉴定为介导哺乳动物自噬的基因，是启动细胞自噬过程的标志分子，其缺失或突变时将明显降低细胞死亡能力，促进细胞恶变增殖，削弱自噬，导致肿瘤发生[11-12]。祁璘等[13]研究报道，Beclin1蛋白在一些肿瘤细胞如直肠癌、宫颈癌细胞中高表达，使肿瘤细胞保持较高的自噬活性。p62蛋白也是一种典型的自噬相关蛋白，其可结合泛素化蛋白，与LC3蛋白形成复合体，导致蛋白转入自噬溶酶体内被降解，自噬发生时，随着蛋白不断降解，p62蛋白含量逐渐降低，其也是检测自噬活性的标志蛋白之一[14-15]。王淅凤[16]研究报道，p62蛋白作为细胞自噬调控过程中的一种可选择底物，其累积提示自噬能力衰退，而当自噬受抑时，作为监测及参与细胞自噬启动的主要因子Beclin1蛋白表达则会降低，提示自噬相关分子Beclin1与p62蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达呈负相关关系。

本研究结果显示，结肠癌组织中Beclin1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常结肠组织，p62蛋白阳性表达率显著低于癌旁正常组织；此外，Spearman秩相关检验结果显示，结肠癌组织中p62蛋白及Beclin1蛋白阳性表达呈显著负相关，因此Beclin1蛋白与p62蛋白可作为结肠癌治疗的潜在靶向分子。本研究还对Beclin1、p62蛋白阳性表达情况与结肠癌患者临床病理特征进行了分析，结果显示Beclin1蛋白阳性表达与结肠癌患者TNM分期及淋巴结转移密切相关。而p62蛋白阳性表达与结肠癌患者临床病理特征无显著相关性，可能与本研究样本量少、检测方法单一等有关，因此仍需进一步加大样本量，采用多种检测手段重复实验以确认Beclin蛋白及p62蛋白阳性表达与结肠癌患者临床病理特征间的关系。

综上，结肠癌组织中Beclin1蛋白高表达而p62蛋白低表达，且Beclin1蛋白阳性表达与患者TNM分期及淋巴结转移密切相关，而p62蛋白阳性表达与患者临床病理特征无明显相关性。