CPNE1通过c-MET调控非小细胞肺癌的增殖

杨 雯 杜雯雯 张 杨 刘泽毅 黄建安

CPNE1是1种非小细胞肺癌的致癌基因，它可以促进肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭。CPNE1的高表达与肿瘤进展、淋巴结转移和远处转移(TNM)显著相关，同时提示着低生存率[1]。Copine1由CPNE1基因编码，主要位于细胞膜和细胞质中，属于copines蛋白大家族中的一员。copines蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白的1个家族，存在于各种真核生物和原生生物中，它是1种可溶性膜结合蛋白，包括N端的两个串联C2结构域和C端的A结构域[2]。C2结构域作为钙依赖性磷脂结合基序，与细胞信号传导和膜传导途径有关[3]。A结构域可与多种细胞内蛋白结合，作为蛋白结合结构域发挥作用[4]。

c-MET是非小细胞肺癌中继EGFR和ALK之后又一新的治疗靶点。c-MET原癌基因位于人类第7号染色体的长臂 (7q21-31)[5]，蛋白产物是c-MET酪氨酸激酶受体(HGFR)，c-MET的配体是肝细胞生长因子(HGF)，能够促进细胞的增殖、存活、迁移、分化和形态改变[6]。在肿瘤中，c-MET受体可以与高选择性配体HGF结合而发生磷酸化激活，通过激活下游的STAT、PI3K/mTOR、和MAPK信号通路，从而促进细胞的增殖、存活、转移与肿瘤血管生成，最终引起疾病进展[7]。

查阅文献发现，目前尚无关于CPNE1和c-MET两种基因在肿瘤中相互作用的研究，本文章旨在探索CPNE1与c-MET癌基因对非小细胞肺癌的发生发展及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

从中国科学院细胞库(上海)采购人NSCLC细胞A549、H1299、SPC-A1、HCC827、PC9、H1975(肺腺癌细胞系)、H226(肺鳞癌细胞系)H460(大细胞肺癌细胞)和BEAS-2B(人永生化正常上皮细胞)。

1.2 主要仪器

荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，PCR扩增仪(德国Eppendorf 公司)，Western blot仪(Bio-Rad)、酶标仪(Thermo)。

1.3 主要试剂

RPMI-1640、DMEM、FBS(美国Gibco 公司)，超敏ECL发光液(美国Thermo公司)，胰蛋白酶(美国HyCone公司),CPNE1慢病毒(abm公司)，jetPRIME转染试剂(法国polyplus公司)。

1.4 Western Blot相关抗体

CPNE1购于Santa Cruz,CA,USA,p-AKT(Ser473)(D9E),AKT,ERK(137F5),p-ERK(Thr202/Tyr202)(D13.14.4E)购于Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA;β-actin和二抗来自Cell Signaling Technology，Danvers,MA,USA。

1.5 RNA干扰序列

两个针对CPNE1不同编码区的si-RNA序列(GenePharma)。靶序列如下siRNA-CPNE1-1:5'-GGACUUCACUGGCUCCAAUTT-3'(sense) and 5'-AUUGGAGCCAGUGAAGUCCTT-3'(antisense);siRNA-CPNE1-2:5'-GCAGGUCUCGCAUGAAUUUTT-3'(sense)and 5'-AAAUUCAUGCGAGACCUGCTT-3'(antisense)。用于c-met基因检测的引物序列：siRNA-MET:5'-GUGCAGUAUCCUCUGACAGTT-3'(sense) and 5'-CUGUCAGAGGAUACUGCACTT-3'(antisense)。

1.6 方法

1.6.1 细胞培养 细胞在含10%胎牛血清(FBS)和1%双抗(50 U/ml青霉素和链霉素)的RPMI 1640培养基中及5% CO2的湿润环境中生长。

1.6.2 RNA干扰 干扰序列5 μl加入jetPRIME buffer(Polyplus)200 μl震荡离心混匀，再加入4 μl(jetPRIME buffer(Polyplus)震荡混匀，感染细胞4 h更换培养基。在转染72 h后，收取细胞RNA及蛋白用于进一步的实验。

1.6.3 过度表达CPNE1的稳定细胞系的构建 为了产生CPNE1稳定过度表达的非小细胞肺癌细胞，合成了1626 bp的CPNE1编码序列片段(中国苏州，genewiz)，并利用内切酶ecori和xbai通过慢病毒释放系统(Clontech，Mountain View，CA，USA)亚克隆到PLVX-IRES新载体中进行表达。用脂质体fectamine 2000(invitrogen)将CPNE1表达结构与包装老化质粒共导入人胚胎肾293 T细胞。人胚胎肾293T细胞在含10%FBS的Dulbecco改良Eagle's培养基中37 ℃下在湿润的5%CO2培养箱中培养48 h，培养后收集包装好的慢病毒，用于感染A549和HCC827细胞。2天后，用400 μg/ml的G418(Amresco，Solon，OH，USA)筛选稳定细胞。

1.6.4 CCK-8法检测转染后细胞的增殖能力 正常培养各组细胞，0.25% EDTA-胰酶消化细胞，计数并按约3.0×103个细胞接种于96孔板各孔中，每孔100 μl完全培养基，每组细胞设置3个复孔，注意96孔板周围一圈加PBS缓解细胞培养基蒸发。然后置培养箱中培养。分别在24、48、72 h向每个孔中加入10 μl CCK-8检测试剂，注意在孔中不能有气泡。37 ℃静置4 h，使用酶标仪于450 nm、630 nm处检测各孔OD值。

1.6.5 RNA提取及定量 实时PCR分析、Western blot、克隆形成方法详见参考文献[1]。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 CPNE1和c-MET在非小细胞肺癌细胞系中的表达

通过Western blot分析了8个NSCLC细胞系和BEAS-2B细胞中CPNE1蛋白和p-MET蛋白的表达(图1)。与正常细胞相比，非小细胞肺癌细胞系中CPNE1表达明显增加，p-MET在正常细胞和肿瘤细胞株中均有表达。可以发现在A549和HCC827细胞中CPNE1和c-MET的表达量均有表达，后续选定该两株细胞进行实验。

图1 CPNE1和c-MET在非小细胞肺癌细胞系中的表达

2.2 过表达CPNE1可以促进肿瘤细胞的增殖

通过慢病毒载体构建CPNE1过表达的细胞，RT-PCR和Western blot显示，与NC组相比， 过表达组CPNE1的mRNA和蛋白表达水平显著升高(图2)，证实CPNE1过表达细胞株构建成功。行CCK8和克隆形成实验，结果显示 CPNE1的高表达可以促进细胞的增殖(图3)。

图2 CPNE1过表达细胞株的构建

图3 过表达CPNE1能促进细胞的增殖

2.3 CPNE1通过激活c-MET促进肿瘤细胞增殖的机制

为了进一步探索CPNE1促进细胞增殖的机制，进行Western blot实验，结果显示，过表达CPNE1可以上调p-MET及其下游的p-AKT、p-ERK信号蛋白，而这些蛋白与细胞增殖相关。以上结果说明，CPNE1可以有效激活c-MET及其下游的p-AKT、p-ERK，从而促进细胞的增殖。这一结果在野生型A549和EGFR突变型细胞株HCC827中均得到证实(图4)。

3 讨论

有研究表明，CPNE1是非小细胞肺癌发生的关键因素，是1种促进体外肿瘤细胞生长、迁移和侵袭能力的癌基因。在前列腺癌组织和骨肉瘤组织中，CPNE1的表达水平亦高于正常组织[8-9]。且CPNE1的高表达与前列腺癌病人的分期、Gleason评分和较差的无复发生存率相关[9]。在copine家族中发现，CPNE3上调也能增强NSCLC的细胞转移[10]。CPNE3与ErbB2相互作用，促进肿瘤细胞迁移[11]。

图4 CPNE1过表达细胞株下游的信号通路

而在本研究中我们发现CPNE1在促进肿瘤增殖过程中激活了c-MET。c-MET不仅可以促进正常细胞组织修复和再生，也可以促进肿瘤细胞增殖、存活、运动和侵袭，与肿瘤的生长、预后以及耐药都有着紧密的联系[12-13]。在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、头颈癌和非小细胞肺癌中已证实，无论是否有基因扩增，c-MET过表达均提示预后不良[7]。本文首次报道了CPNE1其作用机制涉及到c-MET信号通路。CPNE1可以激活c-met从而促进细胞的增殖，引起下游相关的p-Akt、p-Erk信号的升高。

也有研究表明，CPNE1可以通过EGFR影响肿瘤的发生发展，我们的这一发现完善了CPNE1作用于肿瘤细胞的信号通路机制。CPNE1既可以激活EGFR，也可以激活 c-MET，促进肿瘤的发生发展。而EGFR和MET之间亦存在着共激活或交叉作用[14]。另外，在有EGFR突变的非小细胞肺癌中，通过产生MET或AXL等旁路信号激活，可获得EGFR-TKI的耐药性[15]。部分EGFR-TKI治疗后耐药的原因正是由于c-MET的扩增和激活[15-16]。CPNE1与c-MET之间的作用给了我们新的探索思路。

CPNE1与c-MET的作用关系提示其可能与相关基因的靶向治疗存在潜在联系，其机制还需要我们进一步探索，更好地理解c-MET和CPNE1之间的作用机制，有助于更早的找到癌症靶向治疗新的生物标志物。