适配子微流体芯片在鼻咽癌中的诊断价值研究

陈文学 李金高 万祥辉 邹学森 齐淑轶 胡文强 王春阳

鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一[1]。由于鼻咽癌早期症状不明显，发病位置隐蔽[2]，大部分患者就诊时候已经是中晚期，中晚期鼻咽癌患者预后较差[3]。鼻咽癌常用的血清学辅助诊断方法为EB病毒相关检测。EB病毒是与鼻咽癌发生密切相关的病毒[4]，与EB病毒相关的检测是鼻咽癌常用的血清学检测手段，主要包括抗EB病毒衣壳抗原免疫球蛋白A抗体(VCA-IgA、VCA-IgG 、VCA-IgM)，早期抗原抗体(EA-IgA)和EB病毒DNA[5]。CTC虽然是非常有潜力的肿瘤诊断预后标志物[6]，但是外周血CTC数量少、检测困难限制了其应用。适配子是一段具有高特异性高亲和力的单链寡核苷酸序列，通过其特殊的二级结构可以识别相应的靶细胞。相对于抗体，适配子具有更高的亲和力、特异性、容易合成、可以进行化学修饰，因此以适配子为基础的外周血CTC分离技术逐渐被关注。

本研究探讨前期制备出适配子微流体芯片对鼻咽癌的诊断价值[7]。

1 材料与方法

1.1 病例资料

2016年11月至2017年5月本院收治的鼻咽癌初治患者30例，男性18例，女性12例，中位年龄 45(28～72)岁。全部患者经鼻咽活检病理证实为鼻咽癌，病理类型均为低分化鳞癌，临床分期为Ⅰ～Ⅱ期。所有患者均接受鼻咽、颈部CT扫描，电子鼻咽镜及胸部正侧位片，腹部B超及相关实验室检查以明确分期及远处转移，若患者有骨痛症状则行全身骨扫描。临床分期按UICC分期标准进行TNM分期。对照组为10例鼻咽良性疾病患者和体20例检者，其中男性16例，女性14例，中位年龄34岁。

1.2 标本采集

鼻咽癌患者血标本采集2次，分别在放疗前和放疗结束后一周内采集，放疗前鼻咽癌患者10例采集2份全血用于重复性检测。对照组采集血标本1次，鼻咽良性疾病患者在治疗前采血，健康体检者体检时候采血1次。

1.3 试剂

链霉亲和素 (德国Merck公司)洗脱缓冲液： 4.5 g/l葡萄糖，5 mmol/l MgCl2的DPBS磷酸缓冲液。结合缓冲液：0.1 mg/ml酵母tRNA ，1 mg/ml BSA的洗涤缓冲液。捕获缓冲液：结合缓冲液和淋巴细胞分离液以1∶1比例混合组成。

1.4 微流体芯片的制备

PDMS 微流体芯片制作由苏州文灏芯片科技有限公司生产。通过光刻工艺制作SU-8模具，采用PDMS脱模工艺制作PDMS阵列 基片和盖片，通过键合工艺形成封闭微流体芯片。芯片由进样口，反应室，出样口组成，反应室内设置叉排的微绕流柱，微绕流柱为圆形，直径为45 μm，间距为100 μm。

1.5 CTC富集及计数

1.5.1 微流体芯片的预处理 首先用1 mg/ml 亲和素在微流控芯片中作用1 min，结合缓冲液冲洗3次。30 μM生物素标记适配子作用1 min，用结合缓冲液冲洗3次，备用。

1.5.2 CTC富集及计数 用微泵将全血标本输送到微流体芯片反应室，为了避免全血的性状改变，全血肿瘤细胞分离过程中没有加入缓冲液。为防止细胞在泵入过程中浓度不均一，在全血中放入微型磁力搅拌棒，全血细胞在进入过程中不会下沉且保持浓度均一。微泵泵入全血到微流体芯片反应室内，结合缓冲液冲洗3次，洗脱缓冲液洗脱，荧光显微镜观察捕获细胞的数量。

1.6 统计学分析

应用SPSS 20软件进行分析。适配子微流体芯片的敏感性、特异性用ROC曲线分析，重复性用，CTC和临床分期一致性用Kappa 检验，鼻咽癌患者治疗前外周血CTC数目与治疗后和对照组比较用t检验。

2 结果

2.1 CTC在鼻咽癌患者及对照组中的表达水平

鼻咽癌患者治疗前后及对照组外周血CTC计数见图1。同一时间取2管检测的患者CTC取2管的平均值。鼻咽癌患者放疗前CTC中位数是18.5，放疗后是7.5，鼻咽良性疾病患者CTC中位数是7，健康志愿者3 。将CTC分为高、中、低3组，低值组为0～10，中值组为11～30，高值组为>30。鼻咽癌患者组放疗前76.67%样本在中、高值组，经过放疗后下降到23.33%。健康对照组0%在中、高值组。将鼻咽癌患者组、良性疾病组、健康组外周血CTC计数见图2，健康对照组与鼻咽良性疾病组比较无显著性差异(P>0.05),鼻咽癌组与对照组(健康对照和鼻咽良性疾病组)比较有显著性差异(P<0.05)，鼻咽癌组外周血平均CTC细胞数高于对照组。

图1 鼻咽癌患者治疗前后及对照组外周血CTC计数

图2 鼻咽癌患者与对照组外周血CTC计数

2.2 适配子微流体芯片检测的重复性

10例鼻咽癌治疗前的患者同时取2管外周血进行检测，评估适配子微流体检测的重复性(图3)，将检测结果按高值、中值、低值进行分组，统计结果显示两管检测结果具有高度一致性。

2.3 适配子微流体芯片检测的诊断价值

用ROC曲线评价适配子微流体芯片对鼻咽癌的诊断价值，图4为30例鼻咽癌患者，10例鼻咽良性疾病，20例健康对照的ROC曲线，曲线下面积为0.88(95%CI：0.80～0.96)，外周血CTC的cut-off值为9.5时，敏感性77%(95%CI：0.57～0.89)，特异性86%(95%CI：0.68～0.95)，阳性预测值为0.85(95%CI ：0.65～0.95)，阴性预测值为0.78(95%CI：0.61～0.90)。

图3 适配子微流体芯片重复性检测

图4 适配子微流体芯片对鼻咽癌的诊断价值

2.4 CTC与患者临床分期相关性

30例鼻咽癌初诊患者放疗前后分别检测外周血CTC数目，分析外周血CTC数目与鼻咽癌临床分期的相关性。表1显示了鼻咽癌患者临床分期与治疗前后CTC数目，鼻咽癌患者治疗前外周血CTC数目与鼻咽癌临床分期具有较好的一致性，κ值为0.73，治疗后CTC数目与临床分期没有一致性。

3 讨论

随着肿瘤液态活检的兴起，以循环肿瘤细胞为基础的肿瘤液态活检得到广泛的研究。外周血循环肿瘤细胞液态活检技术作为非侵入性检测手段，具有获取血液标本方便，可以追踪肿瘤发展。目前CTC富集的方法主要有免疫捕获法、过滤法、密度梯度离心法等[8-9]，但是这些方法存在获取CTC纯度不高，CTC回收率低、耗时等缺点。最近研究显示适配子微流体富集技术可以有效富集外周血CTC。与其他富集技术相比适配子微流体富集技术具有以下特点①以核酸为基础的捕获技术②可以分离纯化肿瘤细胞并保持细胞活性③捕获效率高。本研究用适配子微流体技术对鼻咽癌外周血CTC进行分析，评价适配子微流体技术检测鼻咽癌外周血CTC对鼻咽癌的诊断价值。

由于循环肿瘤细胞研究的技术手段限制，外周血循环肿瘤细胞富集率低，因此这项检测技术只用于肿瘤治疗疗效判断和预后评估。随着近年微流体技术、芯片技术、纳米技术的发展，外周血CTC细胞的捕获效率明显提高，也出现了一些外周血CTC用于早期诊断与肿瘤筛查的报道。外周血CTC富集方法不同，在不同的肿瘤中甚至在同一肿瘤中CTC在外周血中的检出率也存在一定的差异。CellSearch system(CSS)是经过美国FDA认证的用于临床检测CTC的技术，Bai[10]比较CellSearch system (CSS) 和isolation by size of epithelial tumor cells (ISET)两种方法对肾癌外周血CTC的检出率，CSS 的检出率是19.4%(7/36) ，ISET 的检出率是36.1%(13/36) 。Jaeger[11]对早期乳腺癌的研究中发现，通过CellSearch system对早期乳腺癌外周血CTC的检出率为40.2%(258/642).Liu[12]用自己设计的芯片检测乳腺癌外周血CTC，20例乳腺癌患者阳性率65%(13/20)，Xue[13]用多种标志物定量pcr平台检测乳腺癌患者外周血CTC，阳性率为55%(92/165)。Zhang[14]用免疫磁珠联RT-PCR检测卵巢癌外周血CTC，109例患者外周血CTC检出的 阳性率为90%(98/109)。Li[15]联合CD45阴性富集和FISH技术检测外周血CTC，对于临床Ⅰ期患者，肺癌阳性率64.15%,胃癌阳性率83.33%,乳腺癌阳性率78.95% ，食管癌阳性率68.18%。Qian[16]用滤膜微流体芯片富集肺癌患者外周血CTC,阳性率为86%。本研究通过适配子微流体装置捕获鼻咽癌外周血CTC，鼻咽癌患者外周血CTC高于对照组(健康对照组合鼻咽良性疾病组)，鼻咽癌患者CTC检测的敏感性为77%,特异性为86%。适配子微流体装置的外周血CTC的检出率高于早期的检测方法，与近年来的改进的方法检出率相似，可以实现对鼻咽癌的诊断。

适配子微流体装置检测外周血CTC具有很好的重复性，鼻咽癌患者组放疗前76.67%样本在中、高值组，经过放疗后下降到23.33%，这与预期的放疗疗效一致。放疗后鼻咽癌患者的外周血CTC数目可以反映患者的疗效。

本研究还对鼻咽癌放疗前后外周血CTC数目与患者临床分期进行了分析。数据显示鼻咽癌放疗前外周血CTC数目与鼻咽癌患者的临床分期有显著的相关性(κ=0.73)，与目前的一些研究报道治疗前外周血CTC数目与临床分期或病理分期有相关性的结果相符。放疗后鼻咽癌外周血CTC数目与鼻咽癌患者的临床分期无相关性。因此鼻咽癌放疗前后外周血CTC数目可以作为辅助鼻咽癌患者临床分期的依据。

表1 外周血CTC数目与鼻咽癌临床分期的关系(例，%)

适配子微流体装置检测鼻咽癌外周血CTC数目对诊断鼻咽癌有较好的敏感性和特异性，同时可以反映鼻咽癌患者的放疗疗效。