厚朴酚对斑马鱼（Danio rerio）的急性毒性病理损伤评估

熊关庆，冯 杨，杨玉涔，段惠民，黄彦博，李泉汐，李志洪，石存斌，汪开毓，黄小丽*

（1.中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室，广州 510380；2.四川农业大学动物科技学院水产系，成都 611130；3.四川农业大学动物医学院，成都 611130）

厚朴（Mangnolia officinalis）为木兰目（Magnoliales）木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Mangnolia）植物，其树皮为我国传统中药材，具有湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘及痰饮喘咳等功效。厚朴酚（Magnolol）与和厚朴酚（Honokiol）作为厚朴主要有效成分，二者互为异构体，均具有与厚朴类似的药理作用。近年来，国内外对和厚朴酚的药理学研究较多，且认为其药理作用强于厚朴酚。廖国桐报道和厚朴酚可以减少心肌梗死面积，并在改善局灶性脑缺血再灌注诱导的脑梗死大鼠中表现出抗心律失常作用[1]。研究还发现和厚朴酚能诱导小鼠乳腺癌细胞[2]、A549 人肺癌细胞[3]和 Lewis 小鼠肺癌细胞[4]等肿瘤细胞发生凋亡，并减缓其在活体中的实体瘤形成。此外，和厚朴酚对于神经、心血管疾病、白内障和糖尿病等均具有良好的治疗效果。作为人类疾病治疗当中的有效药物成分，和厚朴酚具有良好的药物开发前景。

不仅在人类疾病中有广泛的药理作用，和厚朴酚在水生动物疾病的治疗中亦有显著的功效。近年来，关于和厚朴酚治疗鱼类疾病的报道越来越多。陈晓慧等发现和厚朴酚抗草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）作用中，对 GCRV 的抑制率超过70%[5]；钟志宏等发现和厚朴酚对于刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans 鲹）导致的卵形鲳 白点病有良好的防治效果[6]。Feng Y.等研究还发现和厚朴酚能较好杀灭水霉菌（Saprolegnia spp.），在鱼类水霉病的防治中具有作用[7]。这些结果表明，和厚朴酚在水生动物药物开发中具有较好的前景，目前对于和厚朴酚的毒性研究相对较少，和厚朴酚在疾病治疗中的安全性还有待进一步评估。

斑马鱼（Danio rerio）为辐鳍鱼纲（Actinopterygii）鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鱼类，是一种理想的脊椎动物模型。研究表明，斑马鱼在分子、细胞和组织水平上和哺乳动物高度相似，并在发育方式[8-9]、疾病发生[10-11]等过程均具有与人类类似的特点，已被广泛应用于人类疾病模型和药物筛选领域[12]。此外，斑马鱼的分类地位也证明其在水生动物药物的毒性评估中的重要地位。作为从厚朴中提取的主要药物成分，和厚朴酚是人类及水生动物疾病治疗当中重要的候选药物。本试验拟使用斑马鱼为试验对象，探究和厚朴酚对斑马鱼的毒性影响，旨在为和厚朴酚在药物开发中的安全性评估提供参考借鉴。

1 材料和方法

1.1 主要试验材料

试验药品：和厚朴酚购自广州晶晶生物有限公司，采用超临界CO2萃取技术提取，纯度≥98%；其他药品如乙醇、甲醛等均为分析纯。

试验动物：试验用健康斑马鱼200 尾，体长（2.91±0.11）cm，体质量（0.3±0.023）g，购自广东省某斑马鱼养殖场，购回后于600 L 暂养池中暂养一周。暂养期间养殖用水为自来水（使用前曝气1 d），每日换水量 1/3～1/2，水温（25±2）℃，pH 7～8，日∶夜比为12 h∶12 h，其间投喂斑马鱼商用饲料。

1.2 动物分组及处理

试验开始前1 d 对斑马鱼停止喂食，选择无伤、健壮的健康斑马鱼165 尾，用于本次和厚朴酚毒性评估。由于和厚朴酚难溶于水，参照保志娟等[13]的方法，试验前用无水乙醇溶解和厚朴酚配置1 g/L 的母液（现配现用），并按不同浓度将母液溶于曝气自来水中配制成试验用液。试验分预试验和急性毒性研究两部分。

预试验：试验设立空白组（曝气自来水）、助溶剂乙醇组（1%）、和厚朴酚组（0.1、1、10 和 100 mg/L）共6 组，每组10 尾鱼。将受试斑马鱼放入1.5 L 试验用液中浸泡喂养，试验期间保持试验条件与暂养条件（水体/环境）相同。试验期间不投喂饲料，并记录各试验组中斑马鱼的死亡情况，并确定和厚朴酚的急性攻毒浓度。

急性毒性研究：试验设立空白组（曝气自来水）、乙醇组（1%）和厚朴酚组（根据预试验设置和厚朴酚浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6 和 0.8 mg/L）共 7 组（3 平行/组，5 尾鱼/平行）。将受试斑马鱼放入1.5 L 试验用液中浸泡喂养，试验期间保持试验条件与暂养条件（水体/环境）相同。试验期间不投喂饲料，每12 h 更换清水/药液1 次，整个试验周期为96 h。其间记录各试验组中斑马鱼的临床症状以及死亡情况，并及时捞出死鱼。

1.3 病理学观察

攻毒试验结束后，取各浓度组的存活斑马鱼，MS-222 麻醉后首先检查病鱼体表完整性及其他体表症状，体视显微镜（永新，中国）下观察内脏器官的大体病理表现。剪除斑马鱼尾部，并将剩余全鱼在腹腔开矢状切口后固定于10%中性缓冲福尔马林固定液中48 h。接着，将样品脱钙24 h，水洗过夜，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片（3 μm），苏木精-伊红（H&E）染色，中性树胶封片。电子显微镜下（Nikon，日本）观察各试验组中斑马鱼的鳃、眼、脑、心脏、肝脏、脾脏、中肾、肠道、性腺、皮肤及肌肉等器官的组织病理损伤情况，并拍照记录。

参照D.Bernet[14]等设计评分体系，对充血和坏死的程度进行打分。根据器官充血和坏死程度，使用从0 到6 的分数对其病变程度（α）进行评估：0 表示无变化；2 表示轻度发生；4 表示中度发生；6 表示严重发生。此外，不同类型的病变对器官功能和鱼类生存的影响能力不同，本试验设计充血和坏死的重要因子（ω），即充血为可逆性变化“1”，坏死为不可逆性变化“2”。不同试验组中每尾鱼的各器官指数（Sorg）：Sorg=∑病变类型α*ω，不同试验组中每尾鱼的总病变指数为：S总=Sorg。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0（IBM，美国）软件进行数据统计。采用Log-rank 检验不同浓度和厚朴酚对斑马鱼致死率的差异性（*P＜0.05 为差异显著，**P＜0.01为差异极显著）。此外，采用单因素方差（one-way ANOVA）分析t 检验方法检验不同试验组中斑马鱼的器官指数和总病变指数差异（不同小写字母表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 和厚朴酚浓度对斑马鱼的死亡率影响

预试验结果显示，在（25±2）℃下，最高浓度100 mg/L 的和厚朴酚能导致斑马鱼在6 h 内出现全部死亡，而10 mg/L 和厚朴酚也能在12 h 内导致斑马鱼出现全部死亡。此外，1.0 mg/L 和厚朴酚组中斑马鱼在24 h 内全部死亡，0.1 mg/L 厚朴酚组中斑马鱼在96 h 内仍未出现死亡。根据预试验结果，选用0.1～1.0 mg/L 和厚朴酚浓度进行斑马鱼急性毒性研究（图1），以分析和厚朴酚半数致死浓度（LC50）和药物安全浓度（SC）。

图1 不同和厚朴酚浓度对斑马鱼的生存率影响（n=15）Figure 1 Effect of honokiol on survival rate of zebrafish （n=15）

急性毒性研究结果显示，0.1～1.0 mg/L 时和厚朴酚对斑马鱼的毒性呈浓度-时间依赖性关系。其中，与对照组和乙醇组相比，0.4 mg/L 和厚朴酚能导致斑马鱼在96 h 内出现显著死亡，而0.6 和0.8 mg/L和厚朴酚能造成斑马鱼在96 h 内出现极显著死亡，并以0.8 mg/L 和厚朴酚造成的死亡最为显著，在96 h时致死率达93.3%（14/15）（图1），而空白组及乙醇组中斑马鱼均未出现死亡。参照寇氏（Kochi）法[15][lgLC50=1/2（mi+mi+1）×（pi+1-pi）；mi为和厚朴酚浓度对数，pi为死亡率]，根据死亡情况计算和厚朴酚对斑马鱼的 96 h 半致死浓度（96 h-LC50）为（0.530±0.014）mg/L，72 h-LC50为（0.679±0.013）mg/L，48 h-LC50为（0.758±0.012）mg/L，24 h-LC50为（0.816±0.01）mg/L。此外，根据Reed-Muench 法[16-17]（SC=48-LC50×0.3×（24-LC50/48-LC50）2）计算 SC 为（0.264±0.003）mg/L。

2.2 和厚朴酚浓度对斑马鱼的毒性病理学损伤

试验期间，各试验组斑马鱼并未表现出明显的临床症状，死亡的斑马鱼无明显大体病理表现，仅有少量死鱼表现为鳃盖向外扩张的现象。由于试验期间0.8 mg/L 和厚朴酚浓度组斑马鱼死亡后组织有自溶现象，因此未对其进行组织病理学分析，而选择 0.2 mg/L（≈SC）和 0.6 mg/L（≈LC50）和厚朴酚组斑马鱼进行分析，以期了解不同和厚朴酚浓度对斑马鱼各器官的影响。与对照组相比，乙醇组及和厚朴酚组斑马鱼出现了多器官组织变化（图2～5，表1），主要表现为乙醇组鳃、肠道、肝脏、中肾和心脏等器官小血管及毛细血管轻微充血，而和厚朴酚组斑马鱼除了表现为多器官充血外，还出现鳃小片呼吸上皮坏死、以及脑严重充血。此外，乙醇及和厚朴酚组中斑马鱼的眼、脾脏、性腺、皮肤和肌肉等器官均未出现明显病理变化。斑马鱼在不同药物处理下各器官的组织病理学变化如下：

不同浓度药液浸泡过程中，斑马鱼鳃为主要损伤部位（表1）。空白组中斑马鱼鳃未出现明显病理变化（图2A）。然而，乙醇组中斑马鱼鳃出现充血症状，其鳃小片增粗、顶端明显肿大（图2B）。相比之下，0.2 和0.6 mg/L 和厚朴酚组中斑马鱼鳃丝均出现肿大、充血加重的情况，鳃小片顶部形成动脉瘤样变（图2C～D）。此外，0.6 mg/L 和厚朴酚组中鳃小片上皮细胞出现明显脱落、坏死的症状（图2C～D）。组织病理学结果表明，以乙醇为溶剂会导致鳃出现充血现象，而和厚朴酚加重了乙醇引起的斑马鱼鳃丝充血肿大的情况。此外，和厚朴酚对斑马鱼鳃呼吸上皮具有毒性作用，高浓度下能导致其出现坏死。

相对于其他器官，脑可能也是和厚朴酚毒性的靶器官之一（表1）。虽然空白组及乙醇组中斑马鱼脑均未出现明显病理变化（图3A～B），然而和厚朴酚组中斑马鱼脑部静脉血管及毛细血管出现中度至重度充血（图3C～D），说明和厚朴酚可能通过改变血管通透性最终透过斑马鱼的血脑屏障。

图2 和厚朴酚对斑马鱼鳃组织的毒性评估Figure 2 Toxicity assessment of honokiol to zebrafish gill

肠道的病理变化较轻（表1），空白组中斑马鱼肠道未出现明显病理变化（图4A），而乙醇组中少量试验鱼肠道固有层及肌层内血管出现轻度充血症状（图4B）。相比之下，0.2 和0.6 mg/L 和厚朴酚组中斑马鱼肠道内无明显充血症状及其他明显病理变化（图4C；0.6 mg/L 和厚朴酚组）。组织病理学结果表明，和厚朴酚对于斑马鱼肠道并不具有明显毒性作用。

图3 和厚朴酚对斑马鱼脑组织的毒性评估Figure 3 Toxicity evaluation of honokiol on zebrafish brain

图4 和厚朴酚对斑马鱼肠道的毒性评估Figure 4 Toxicity assessment of honokiol on the zebrafish intestine

此外，乙醇组中斑马鱼肝脏（图5B）、中肾（图5E）及心脏（图5H）均出现明显的充血症状；与乙醇组相比，0.2 和0.6 mg/L 和厚朴酚组中斑马鱼相应部位（图5C，F，I；这里仅列出 0.6 mg/L 和厚朴酚处理组）虽然亦出现明显充血，但并未出现充血加重的情况及其他病理变化（图6）。结果表明，和厚朴酚可能未对斑马鱼肝脏、肾脏及心脏等器官产生明显毒性影响。

此外，乙醇及和厚朴酚组中斑马鱼的眼、脾脏、性腺、肌肉和皮肤等器官均未出现明显病理变化。

图5 和厚朴酚对斑马鱼肝、肾及心脏的毒性评估Figure 5 Toxicity evaluation of honokiol on liver， kidney and heart of zebrafish

图6 各组组织病理学评分（数据以平均值±标准差表示，n=3）Figure 6 Histopathological scores of each group（mean±SD， n=3）

3 讨论与结论

和厚朴酚作为厚朴提取物，其抗肿瘤、抗菌等药理作用已被广泛研究，无论在人类还是水生动物疾病的药物开发中均具有重要前景。然而，目前对于和厚朴酚的安全性研究较少，对于其药物开发中可能产生的毒性知之甚少。本研究通过和厚朴酚对斑马鱼的急性毒性病理学研究，确定高浓度的和厚朴酚对斑马鱼有致死作用，其96 h-LC50为（0.530±0.014）mg/L，72 h-LC50为（0.679±0.013）mg/L，48 h-LC50为（0.758±0.012）mg/L，24 h-LC50为（0.816±0.01）mg/L，而 SC 为（0.264±0.003）mg/L。此外，鳃可能为和厚朴酚的主要毒性靶器官，在和厚朴酚浸泡处理下能够导致鳃呼吸上皮出现坏死。和厚朴酚对于斑马鱼其他器官无明显损伤作用，证明了其适宜浓度在药物开发当中所具有的安全性。

呼吸系统是鱼类与水环境最重要的接触界面，鳃小片是鱼类进行气体交换的场所[18]。本研究发现和厚朴酚浸泡可引起斑马鱼鳃充血，鳃小片增粗、顶端肿大膨胀以及鳃呼吸上皮坏死等病理变化。有报道和厚朴酚能够导致细胞膜通透性改变并诱导细胞死亡[19]，其可能具有损伤鳃上皮的能力。鳃的损伤可能导致斑马鱼呼吸系统动态平衡被打破，与外界气体交换受阻，最终造成鱼体死亡。虽然和厚朴酚对于杀灭鱼体表面病原微生物具有良好的效果[6-7]，但根据本研究结果表明，鱼类并不适应长期暴露于高浓度和厚朴酚的环境当中，以免导致鳃出现不可逆的损伤。

脑作为生物机体的神经中枢，在调控机体活动与生命代谢中发挥着重要作用。本研究结果发现，和厚朴酚虽未造成脑部明显损伤，但会引起脑部血管出现明显充血症状。和厚朴酚作为一种小分子多元酚化合物，能够通过血管内皮细胞间的紧密连接穿越血脑屏障[20]。此外，研究发现和厚朴酚具有良好的脑保护作用，可缩小脑梗死范围，降低脑含水量和减轻脑组织坏死[1，21]。于妮娜等发现和厚朴酚还能显著改善犬脑缺血再灌注模型中脑部血流量和血压[22]。因此，和厚朴酚可能通过血脑屏障进入脑部，提高脑部血压，最终保护脑免受缺血性损伤。然而，对于健康生物脑部，和厚朴酚可能引起脑血管充血，在使用和厚朴酚进行全身性给药时，可能需要注意其对脑部产生的副作用影响。

此外，作为一种有效的模式生物模型，斑马鱼在人类及鱼类药物筛选模型中发挥着重要作用。急性攻毒条件下，和厚朴酚对于斑马鱼无明显视毒性、肾毒性、心脏毒性、肝毒性、肠道毒性以及生殖毒性，表明其在急性毒性评价中的安全性较高。因此，无论对于人类还是水生动物进行和厚朴酚药物的开发或许均具有巨大潜力。前期的研究发现和厚朴酚对水霉菌有较好的抑制效果，本研究通过和厚朴酚对斑马鱼急性毒性试验结果确定和厚朴酚对鱼类毒性较小。因此，在后期鱼类药物研制中可根据安全浓度和药效结果来选择最佳浓度，开发一种新的水产中药。