提高四川平原地区的马铃薯杂交制种效率研究

邹 雪，丁 凡，刘丽芳，余韩开宗，陈年伟，余金龙

（绵阳市农业科学研究院，四川绵阳 621023）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）适应性强、产量稳定、营养全面，至2017 年在中国的种植面积已达576.51 万hm2，总产9 914.70 万t，均列世界第一（FAO，2017）。马铃薯既可菜用又能加工成薯条、薯片和面食等，培育符合市场多元化需求的优良专用新品种是产业长远发展的关键。

马铃薯主要依靠块茎上的芽无性繁殖，同时在特定条件下也能产生植物学意义上真正的种子进行有性繁殖。常规马铃薯栽培品种属同源四倍体且遗传组成高度杂合，增加了优良品种选育难度，且一些主要商品性状如块茎产量、数量和比重等会受环境影响，无性世代品系需多年多点评价，通常育成一个品种需要10 年左右的时间。有性杂交结合海量筛选是国内外马铃薯品种选育的主要途径[1-3]。

马铃薯起源于南美洲，短日照条件促进结薯，长日照条件促进开花。花量、花期既和光周期相关，也和品种熟期密切相关。一般早熟品种花量少，花期短，而中晚熟品种花多且花期长[4]。环境因素影响马铃薯开花和坐果，即使马铃薯杂交制种是一项非常传统的技术，但不同生态条件以及管理水平的差异使得各地制种效率存在明显差异。能大量开花是制种的前提条件，光照充足且长日照能够促进马铃薯花芽分化，尤其对本身开花数量少的品种。四川可多季种植马铃薯，但仅有春季属于长日照季节利于马铃薯开花。川内平原低海拔地区因光照不足，能开花的材料少且花期短，即使坐果也常因5—6月的持续高温而掉果，一般不在这些地区开展杂交制种工作；川西北高原地区海拔3 000 m 以上的自然环境适合马铃薯开花，但较为偏远，材料管理不便，因野生动物破坏或晚疫病突发等情况使得果实采收率低，同时这些地区选育的品种偏晚熟，不适合四川平坝地区种植。平原地区杂交制种效率低是制约选育适宜该地区品种的关键原因。除光照对马铃薯开花至关重要，授粉时的环境湿度也起关键作用，研究表明马铃薯田间杂交授粉的坐果率一般只有2%，而在利于保湿的网棚和温室中的坐果率远高于大田[5]。

本试验从激素、温湿度、光照和亲本选择等方面综合研究这些因素对四川平原地区马铃薯开花和杂交坐果的影响，同时结合周边山区较平坝区晚开花的生态互补优势来延长授粉时间，建立适于平原地区的高效杂交制种技术，期望为选育适宜该地区的优良品种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从国际马铃薯中心（CIP）、国家马铃薯改良中心克山分中心引进以及地方收集的马铃薯资源材料中选择31 份作为本试验材料，由绵阳市农业科学研究院提供。

1.2 诱导开花与杂交授粉

低海拔平原地区试验点位于绵阳市农业科学研究院网棚（松垭镇，海拔约500 m）。试验主要于2016 年1—7 月进行，并在2017—2019 年的1—7月进行激素诱花试验和杂交制种的补充验证。亲本材料的脱毒种薯用20 mg/L GA3浸泡20 min 后盆栽，每个材料12 盆，每盆2～3 个薯块。基质按营养土∶蛭石∶椰糠=7∶1∶2 比例，并在中间层加入 50～80 g复合肥/盆，出苗 20 d 后补施尿素（100 g/盆）促进地上部生长，抑制结薯。此外在农科院大田和山区（位于北川羌族自治县兴羌生态农业科技开发有限公司网棚，海拔约1 200 m）种植材料用作父本取花粉。网棚和山区两地相距70 km，往返耗时1.5 h。

1.2.1 平原地区网棚内的诱花试验

设置 LED 灯（每支 24 W 120 颗灯珠，红∶蓝=7∶1）延长光照诱花处理：随机选择7 份材料，4 盆为1 个处理，设置对照，4∶00开—8∶00 关、19∶00 开—21∶00关，处理之间以叠加的6 层黑色遮阳网隔开，以防干扰。

设置激素诱花处理：随机选择7 份材料作为对照，诱花处理24 份材料，每份材料12 盆。对照CK喷施清水；处理1：100 mg/L GA3（赤霉素）；处理2：48 μg/L 24-eBL（24-表油菜素内酯）；处理 3：100 mg/L GA3+48 μg/L 24-eBL，出苗后 20 和 35 d 喷施。统计株高、分支和花期等指标。

设置授粉前湿度处理：对照不作处理，于4 月14 日进行授粉；处理1 授粉前用水管浇灌整个大棚，于4 月6 日进行；处理2 先用小喷壶向去雄蕊的花朵喷水雾再授粉，于4 月24 日和5 月31 日进行，每次授粉时间约4 h。

1.2.2 平原地区网棚内的杂交授粉

取花药开裂的新鲜花朵，室内摊晾4～6 h 后收集花粉于PCR 管中，冻存于4 ℃一周内使用均有效。取乙酸45 mL，蒸馏水55 mL，煮沸后加洋红1 g，搅拌均匀并加1 颗铁锈钉，煮沸10 min，冷却过滤，配制成醋酸洋红染液贮存于棕色瓶备用。取少许花粉于载玻片上，染色后去除多余染液，在Olympus BX51显微镜的 10×10 倍视野下观察，每片选择3～5 个视野，着色浅和畸形的花粉粒均无活力，统计花粉活力情况。

用镊子去除颜色开始转变为黄色但还未裂口的花药，再将雌蕊柱头粘取花粉完成授粉，30 d 后统计坐果率，坐果率%=100×坐果数/授粉花数。试验随机配制约122 个组合，每个组合授粉花数超过20朵。

1.2.3 种子收集保存

浆果变软时采收，挂于室内后熟约14～20 d 将种子洗出，室内晾干后于干燥低温条件下贮藏。

2 结果与分析

2.1 生长调节剂对植株生长及开花的影响

随机选择材料进行喷施处理，由表1 可知100 mg/L GA3处理促进植株地上部生长，株高均值增加了60.78%，差异显著，其中青薯9 号在所有材料中最高，达到170 cm 左右。24-eBL 处理则明显促进分支增多，是对照的2.26 倍。地上部的旺盛生长为开花和结实贮备营养，是最终获得种子的重要前提条件。

几种处理均能不同程度的促进开花，延长花期。生长调节剂处理24 份材料，只有3 份未开花，开花率为87.50%，且开花繁茂（单株每天开花数超过15 朵）的材料有11 份；未处理材料7 份，只有4份开花，开花率为57.14%，且花数少，没有材料属于开花繁茂型。说明生长调节剂不仅能提高开花率，而且能促进花芽分化。同时生长调节剂还能缩短从现蕾到开花需要的时间，各处理从现蕾到开花平均需要约11 d，而未处理材料平均需要16 d。激素处理形成更多花序因而能延长花期，其中以组合48 μg/L 24-eBL+100 mg/L GA3处理效果最佳。该处理下材料A10（CIP 编号395109.29）的花期最长可达76 d，所有材料的平均花期60 d，而未处理材料的花期最长只有35 d，平均只有26.75 d（见表1）。

2.2 温度和湿度对坐果的影响

试验在4 月上、中、下旬和5 月底分4 次授粉，随机配制了122 个组合，有82 个组合最终收获种子。4 个批次授粉时的温度和湿度差异对坐果影响明显，通过增加授粉时的湿度能明显提高坐果率。

网棚中的温、湿度变化及授粉时间点如图1 示，第1 批授粉温度在20 ℃左右，授粉前对植株浇水使湿度增高到90%，是非常适合马铃薯坐果的条件，该批次的平均坐果率在4 个批次中最高，为37.5%（见表2）。第2 批和第3 批授粉时的温、湿度情况相似，温度均在25 ℃左右，而湿度只有50%左右，对于授粉来说环境湿度偏低。授粉环境条件最差的是第4 批次，温度超过了35 ℃且湿度低至32%。但对比表2 中的坐果率和单果种子数，可以看出第3 批和第4 批的坐果率较为接近，而这两批次的共同点是授粉前向去雄蕊的花朵喷水雾增加了局部湿度。第2 批与第3 批的授粉环境相似，但第3 批授粉前补湿，使坐果率和单果种子数明显增加，其中坐果率是前者的2.56 倍。第4 批的授粉环境最差，却因增加雌蕊柱头湿度提高了坐果率，单果平均种子数与第1 批相似。上述结果说明授粉前补充柱头湿度能够缓解环境的不利因素，保证坐果率和种子数。

2.3 平坝区和山区开花差异分析

试验有25 份材料在两地同时种植，对平坝区进行生长调节剂喷施处理，其中16 份在两地均开花，5 份材料仅在山区开花，2 份材料仅在低海拔的平原地区开花，2 份材料在两地均没有开花。平坝区的材料虽有诱花处理但开花材料仍没有山区多，说明海拔高、光照强的山区具有利于马铃薯开花的天然地理优势。由于低海拔平原地区温度升高的时间要早于高海拔山区，多数材料在平坝区的开花时间明显早于山区，最多可以提前21 d（见图2）。但GZ3-D、GZ2、GZ5 这 3 个材料的开花时间正好相反，在山区要早于平坝区。在延长平原地区母本花期的情况下，本试验进一步利用平原和山区的花期差异，将山区作为花粉来源，能保证高活力花粉的供应，使授粉时间得以延长，能提高获得种子的数量。

表1 外源激素对株形和花期的影响Table 1 Effects of exogenous hormones on plant morphology and florescence

图1 网棚内的温度和湿度变化Figure 1 Variation of temperature and humidity in net shed

表2 增湿处理对授粉的影响Table 2 Effects of humidification treatment on cross-pollination

图2 不同海拔高度对开花时间的影响Figure 2 Effects of different altitude on flowering time

2.4 亲本组合对杂交效率的影响

亲本的遗传差异造成组合间的杂交亲和性问题，使得组合间的坐果率、单个果实所结种子数差异明显。本试验中，坐果率最高的组合可达100%，如C8（CIP 392780.1）×绵 R、B12（CIP 800290）×川芋 56；而一些组合授粉50 朵以上仍无坐果，如A10（CIP 395109.29）×中薯 2 号、A8（CIP 395193.6）×川芋 56；单个果实中的种子数最高为268 粒，最低为0 粒。

材料 A10 和 A6（CIP 396031.108）作母本的杂交配合成功率高，分别为92.86%（13/14）和85.71%（12/14）。由图3 可以看出与相同的父本杂交，A10的坐果率大多高于A6 的，前者33.33%～80%，后者6.87%～50.00%，但A10 平均每个果实所结种子数大多低于A6，其中A6 与GZ3-D 组合的种子数高达208 粒/个。此外，两者所结果实差异也非常明显，如图4 所示A6 所结果实均为椭圆形、壁薄籽多；而A10 所结果实均为圆形、壁厚，种子相对较少。两者都不适合作父本，醋酸洋红染色检测显示A6 的花粉粒形状不规则且着色浅，畸形率高达81.71%；A10花粉的畸形率虽不高，但可育性差，在其作父本的8个组合中仅1 个组合收获2 个果实15 粒种子。

材料绵R 作父本随机与11 个材料杂交都能坐果，坐果率在25%～100%，其中有5 个组合的坐果率高达100%，说明它作为父本不仅可育性强而且亲和力极高。这些果实所结种子平均97.40 粒/个，处于中上水平。但绵R 不适合作母本，其作母本只1 个组合坐果，但果实无种子（见图4）。

此外，本试验中的光照处理的结果表明，每天延长光照6 h 具有使开花提早的作用，以材料B11（CIP 编号800290）的反应最敏感，比CK 提早开花约20 d 左右。但延长光照在促进植株生长、增加开花数量以及延长花期等方面的作用不如激素处理的效果明显。

3 讨论与结论

图3 A6 与A10 花粉染色以及作母本的坐果和种子数比较Figure 3 The pollen staining and the comparison of fruit setting and seed number of different combinations of A6 and A10 as female parent

图4 杂交坐果（上排）和不同母本产生的种子数量对比（下排）Figure 4 Hybrid fruit setting (upper row) and the number of seeds comparison produced by different maternal parents (lower row)

四川平坝地区春、夏季的日照时间对短日照型马铃薯诱导开花足够，而对长日照型品种则由于光照时间、强度不足而不开花或花量少。延长光照时间可促进鸢尾花期提前50～56 d，增加花数和开花时长7～14 d[6]。蔺草在生育前期延长日照显著促进开花，遮光处理则降低分蘖，减少草茎开花率和每花序小花数[7]。利用LED 灯增加光照时间能增加成都平原地区马铃薯开花数量、周期并增强开花期间对低温的抵抗能力[8]。本试验用LED 灯增加光照时间具有促进能开花的品种花期提前的作用，与前人研究相似，但在促进开花数量和花期方面的作用效果没有激素处理明显，推测试验所选地点海拔已有500 m，在4 月份以后的光周期能满足部分材料开花，这一地区开花弱更可能是光照强度不足造成。试验发现含花青素的彩色薯材料GZ3-D、GZ2 和GZ5 在山区的开花时间早于平原区，与其他材料的结果相反，而山区的光照强度要高于平原地区，推测它们开花需要强光刺激。彩色薯材料开花是否需要更强的光刺激，赤霉素处理能否缓解这一问题，还有待进一步研究。

利用酶联免疫法测定马铃薯花芽分化过程中的内源激素，表明开花品种的ABA/GA3、ABA/IAA 的比值均高于未开花品种，认为较低水平的IAA、GA3和高水平的ABA 有利于促进马铃薯花芽分化[9]。但研究证实外源喷施GA3能促进马铃薯花芽分化，提高开花数量和花粉量[10]。吴巧玉等[11]对马铃薯喷施GA3能促进开花性弱的早熟材料开花，使开花性强的中、晚熟材料提前开花并延长花期。油菜素内酯BR是一类甾醇类植物激素，参与调控多种生理过程，如气孔形成、植株形态建成、开花、维管束发育和种子萌发[12]。过量表达油菜素内酯合成关键基因AtDWF4的转基因芥菜，其内源BR 水平提高，结荚数和种子数均增加[13]。Huang G.等[14]研究表明外源 BR 处理促进非洲菊花瓣的生长，且作用效果强于赤霉素，转录分析表明BR 处理30 min 内即能激活多种转录因子表达。本试验喷施GA3和BR 均能促进马铃薯开花，但前者主要促进株高而后者促进更多分支的形成，两者互配使用促进开花的效果最佳，说明两者对马铃薯的开花具有协同增效性。研究表明赤霉素与油菜素内酯具有互作效应，Tong H.N.等[15]证实水稻BR 信号转导中的转录因子BZR1 能与GA合成相关基因的启动子结合，促进或抑制基因的表达以调节GA 代谢从而调节细胞伸长。在拟南芥中也证实BR 通过促进GA 合成调控生长[16]。两者在促进马铃薯开花上的互作机制还需进一步研究。本试验中光照与激素处理均有促进马铃薯开花的作用，但激素处理的效果更明显，推测激素促进了植株生长，为形成更多花序奠定基础，使得花量和花期增加明显。

授粉前的环境湿度是授粉能否成功的关键，在云南高原开展马铃薯杂交授粉，灌水处理的平均坐果率提高了61.48%[16]，这与本试验中授粉前增湿处理提高坐果率一致，并且在平原地区增湿处理对提高坐果率的效果更明显，高达3.25 倍。温度也是影响马铃薯坐果的关键环境因子，温度高于30 ℃时花粉母细胞减数分裂不能正常进行，花粉粒会在柱头上死亡，降低坐果率[10]。四川平坝地区进入5 月后气温偏高，以往认为不适合开展马铃薯授粉，但本研究表明通过增湿可减缓温度过高造成的不利影响，将授粉时间延长到5 月底。因此在平坝区制种，可通过授粉前的增湿处理解决温度过高、湿度过低造成的低坐果率问题。

明确各材料间的亲和性是进行亲本选配，成功获得实生种子的关键。吕文河、齐海英等[18-19]对杂交亲本进行杂交效果分析，提出以坐果率和收获种子量来综合评价亲本的杂交效应。彩色马铃薯亲本杂交时同样发现不同材料间的亲和性差异明显[19-20]。本试验发现不同材料间的杂交效应差异明显，材料绵R 作父本的杂交配合效率可以达到100%，并且与不同材料杂交的坐果率均较高，其花粉高亲和力的原因有待进一步研究。

本试验在四川低海拔的平原地区制种，通过喷施激素诱导开花并延长花期，解决了长期制约马铃薯在平原地区不开花或花量太少的问题；通过增湿设施能改善平原地区温度高、湿度低不利于坐果的问题。同时合理利用当地多样化的生态优势，将周边山区作为采集花粉来源地以延长授粉时间，能够提高杂交制种效率和种子获得量，为选育本地区的优良马铃薯品种奠定基础。