“黑美人”马铃薯原花青素代谢物动态分析

杨晓辉，蔡慧珍，汪 岭，赵 聪

（宁夏医科大学公共卫生与管理学院，宁夏银川 750004）

0 引言

原花青素（Proanthocyanidins，PC）作为一种自然界存在的黄酮类聚合物［1］，又名缩合鞣质，广泛存在于植物界和食品中，具有很强的生物活性［2］，且安全性高。原花青素被认为是目前清除体内自由基最为有效的天然抗氧化成分之一［3］，具有抗氧化、降低血脂、降低血糖、抗癌、免疫调节等多种功效［4］，并有防止心血管疾病、抗辐射、防血小板凝结等作用［5-6］。因此，原花青素在药品、保健品、食品及化妆品等多领域应用广泛［7］。目前关于原花青素的研究也卓有成效，但大多是关于原花青素的提取、结构及生理活性的研究，原花青素在体内的吸收和代谢过程的研究还需要进一步深入［8］。

经研究表明：“黑美人”马铃薯原花青素含量较高，其营养价值比普通马铃薯高［9］。笔者经过试验发现，“黑美人”马铃薯中原花青素在大鼠血清、尿液、粪便中均有不同含量的存在，且灌胃天数不同，其含量差异较大，但其在体内的吸收和代谢过程尚不明确。本研究将采用液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）技术对“黑美人”马铃薯原花青素给药大鼠不同给药天数的尿液和粪便中代谢产物进行分析，研究“黑美人”马铃薯原花青素的主要代谢产物及其动态变化规律，探讨“黑美人”马铃薯原花青素的代谢特征，为“黑美人”马铃薯原花青素体内代谢机制探索提供依据。

1 实验部分

1.1 实验动物

成年SD大鼠20只（雌雄各半）。

1.2 仪器与试剂

Rapid Trace SPE自动固相萃取仪（瑞典Biotage AB公司）；1100液相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；九阳料理机（JYL-C012-九阳股份有限公司）；高速离心机（Neofuge15R-上海力申科学仪器有限公司）；数控超声波系统（KQ-100DE-昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

“黑美人”马铃薯；原花青素标准品（95%）（北京上立方联合化工技术研究院）；乙酸乙酯；无水乙醇；甲酸；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.3“黑美人”马铃薯原花青素的制备

将“黑美人”马铃薯洗净、晾干，用榨汁机制成匀浆，精确称取100.0 g于烧杯中，依照料液比例1∶7.5（W/V）加入75%的乙醇溶液，并在60℃超声波仪中提取30 min。将提取后的溶液在离心沉降器上以转速为1 000～3 000 rpm递增的速度离心5 min，将上清液进行真空抽滤，挥发除去挥发性萃取剂，并使用AB-8大孔吸附柱分离和纯化，得到原花青素粉末。

1.4 样本采集与前处理

1.4.1 样本采集

将成年SD大鼠随机分为实验组和对照组（实验组和对照组分别分成1，2，3，5，7 d组，每组雌雄各半）。实验组给予“黑美人”马铃薯原花青素的提取物，以150 mg/（kg·d）的剂量灌胃给药，对照组给予相应剂量的生理盐水，分别灌胃给药1，2，3，5，7 d，管饲量为大鼠体重的1%，每日上午十点左右灌胃，其他饮食保持正常，将大鼠放在代谢笼中单笼喂养。分别收集1，2，3，5，7 d组大鼠的排泄物（尿液、粪便），清晰标记，并保存在-80℃的冰箱中。

1.4.2 样本的提取与净化

分别精确称量不同天数的SD大鼠尿液1.0 mL置于试管中，按照1∶9（V∶V）加入75%的乙醇溶液，于60℃超声波提取1 h，离心取上清液；取不同给药天数的SD大鼠粪便，研磨成粉末，分别称取1.0 g，按1∶9（W∶V）加入75%的乙醇溶液，并在60℃超声波仪中提取1 h，离心取上清液。上述各组上清液经旋转蒸发仪减压浓缩，乙酸乙酯萃取后溶于30%乙醇中，将其转移至已活化的C18固相萃取小柱中纯化，收集样液，于0.25μm有机微孔滤膜进行过滤，进行HPLCMS分析。

1.5 液相色谱-质谱条件

LC条件：色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）。洗脱梯度（0～10 min，A 5%～10%；10～20 min，A 10%～15%；20～30 min，A 15%～20%；30～40 min，A 20%～40%；40～50 min，A 40%～60%）；流速1 mL/min；检测波长280 nm；柱温45℃。

ESI-MS条件：采用电喷雾离子源（ESI）电离，负离子模式下采集数据，孔压－30 V；雾化压力4 kV；气体流速20 mL/min；离子源温度325℃；质谱离子扫描范围100～1 200 m/z。

1.6 数据处理

数据以X±S表示，由Origin8.0软件进行分析，组间差异表现为P＜0.05和P＜0.01。

2 结果与讨论

2.1 大鼠尿液中代谢产物及动态分析

在1.5所述条件下，将纯化后1，2，3，5，7 d对照组和实验组给药大鼠尿液中原花青素的代谢产物进行LC-MS分析，总离子流如图1所示。结合标准品的保留时间和质谱信息分析表明，在实验组的尿液代谢产物中有（-）-表儿茶素（产物Ⅰ）、表儿茶素苄硫醇（产物Ⅱ）和m-香豆酸（产物Ⅲ），且三者含量在给药1，2，3 d有明显差别（如图2所示），然而，3种化合物在对照组的尿液代谢产物中未检测到。根据统计学分析，实验组给药3 d后SD大鼠尿液中代谢产物的响应值最高，3 d后大鼠代谢趋于稳定，但都和对照组尿液的检出值存在显著性差异（P＜0.01）。

图1 实验组（a）和对照组（b）给药3d后尿液代谢产物的LC-MS总离子流

图2 实验组大鼠给药前后7 d尿液代谢产物的含量变化

笔者在前期的实验中发现，“黑美人”马铃薯原花青素主要是由表儿茶素结构单元组成的原花青素聚合物，本实验中，尿液中原花青素的代谢产物（-）-表儿茶素和表儿茶素苄硫醇的浓度先升高后逐渐平稳，这可能是由于在开始给药时动物对外源物质的耐受性较差以及体内酚类物质的代谢酶活性没有被完全激活，随着原花青素被利用的程度逐渐增加，代谢产生的酚类化合物的含量相应增加。m-香豆酸是由肠道微生物群降解黄烷醇产生的重要酚酸，具有多种抗氧化和抗炎活性，因此，原花青素可以通过增加尿液中酚类物质的排泄来增加尿液的抗氧化活性，进而对整个尿路的免疫机能产生正面影响［10］。

2.2 大鼠粪便中代谢产物及动态分析

在1.5所述条件下，将纯化后1，2，3，5，7 d的对照组和实验组给药大鼠粪便中原花青素的代谢产物进行LC-MS分析，总离子流如图3所示。结合标品的保留时间和质谱信息分析表明，实验组的粪便代谢产物中仍然有表儿茶素苄硫醇（化合物Ⅱ）和m-香豆酸（化合物Ⅲ）存在，但其含量低于尿液，未检出化合物（-）-表儿茶素。粪便中表儿茶素苄硫醇和m-香豆酸含量在给药1，2 d有明显差别（见图4），在对照组的粪便代谢产物中未检测到这两种化合物。根据统计学分析，实验组给药2 d后SD大鼠粪便中二种代谢产物的响应值最高，3 d后SD大鼠的代谢趋于稳定，但都和对照组粪便的检出值存在显著性差异（P＜0.01）。“黑美人”马铃薯原花青素通过粪便排泄的代谢产物主要有两种，不仅远没有尿液排泄的复杂途径，并且含量均较低。

图3 实验组（a）和对照组（b）给药2 d后粪便代谢产物的LC-MS总离子流

图4 实验组大鼠给药前后7 d粪便代谢产物的含量变化

3 结语

“黑美人”马铃薯原花青素在SD大鼠尿液和粪便中的排泄及其作用与代谢途径密切相关。本研究采用LC-MS法对“黑美人”马铃薯原花青素给药SD大鼠不同给药天数的尿液和粪便中代谢产物进行分析，筛选出表儿茶素苄硫醇和m-香豆酸为主要代谢成分，并研究其动态变化，为“黑美人”马铃薯原花青素的体内代谢机制探索提供依据。